21 DECEMBRE 2006. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 6 décembre 1978 relatif à la lutte contre la brucellose bovine et l'arrêté royal du 30 avril 1999 relatif aux conditions de police sanitaire régissant les échanges intracommunautaires de bovins et de porcins

ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et à venir, Salut.

Vu la loi du 24 mars 1987 relative à la santé des animaux, notamment le chapitre III, modifié par les lois des 28 mars 2003 et 27 décembre 2005;

Vu l'arrêté royal du 6 décembre 1978 relatif à la lutte contre la brucellose bovine modifié par les arrêtés royaux des 20 janvier 1988, 27 janvier 1989, 10 janvier 1990, 9 janvier 1991, 28 novembre 1991, 17 avril 1992, 19 août 1992, 20 octobre 1992, 19 juillet 1996, 10 septembre 1996 et 13 juillet 2001;

Vu l'arrêté royal du 30 avril 1999 relatif aux conditions de police sanitaire régissant les échanges intracommunautaires de bovins et de porcins;

Considérant le règlement (CE) n° 535/2002 de la Commission du 21 mars 2002 modifiant l'annexe C de la directive 64/432/CEE du Conseil et la décision 2000/330/CE;

Considérant la décision 2003/467/CE de la Commission du 23 juin 2003 établissant le statut officiellement indemne de tuberculose, de brucellose et de leucose bovine enzootique des troupeaux de certains Etats membres et régions d'Etats membres;

Considérant la décision 2004/226/CE de la Commission du 4 mars 2004 autorisant les essais de recherche d'anticorps contre la brucellose bovine dans le cadre de la directive 64/432/CEE du Conseil;

Vu l'avis de l'Inspecteur des Finances, donné le 25 octobre 2005;

Vu la concertation entre les Gouvernements régionaux et l'Autorité fédérale le 24 avril 2006;

Vu l'avis du Comité scientifique institué auprès de l'Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire, donné le 15 mars 2006;

Vu l'avis n° 41.306/3 du Conseil d'Etat, donné le 28 septembre 2006, en application de l'article 84, § 1er, alinéa 1er, 1°, des lois coordonnées sur le Conseil d'Etat;

Sur la proposition de Notre Ministre des Affaires sociales et de la Santé publique;

Nous avons arrêté et arrêtons :

Article 1er.Dans l'article 2 de l'arrêté royal du 6 décembre 1978 relatif à la lutte contre la brucellose bovine, les points 1 et 2 sont remplacés par la disposition suivante : « 1. Bovin atteint de brucellose : le bovin chez lequel les examens de laboratoire ont décelé soit : a. la présence de brucellas;b. un ELISA positif réalisé par le Laboratoire national de référence. Et, dans le cas particulier d'un foyer ou dans les exploitations contaminées ou suspectes de l'être, le bovin qui présente des signes cliniques de brucellose. 2. Bovin suspect d'être atteint de brucellose : est suspect d'être atteint de brucellose le bovin qui soit : a) a avorté ou présente des symptômes avant-coureurs d'un avortement ou consécutifs à celui-ci, b) présente une réaction positive lors de l'épreuve de l'anneau sur le lait, c) fait partie d'un troupeau dont l'épreuve de l'anneau sur le lait de mélange présente une réaction positive; d) présente un titre agglutinique égal ou supérieur à 30 U.I. par millilitre lors d'un examen sérologique. ».

Art. 2.L'annexe Ire du même arrêté est remplacée par l'annexe 1re du présent arrêté.

Art. 3.L'annexe II du même arrêté est remplacée par l'annexe 2 du présent arrêté.

Art. 4.L'article 7.2.b) de l'arrêté royal du 30 avril 1999 relatif aux conditions de police sanitaire régissant les échanges intracommunautaires de bovins et de porcins est remplacé par la disposition suivante : « b) provenir d'une exploitation bovine officiellement indemne de brucellose, et dans le cas d'animaux non castrés, âgés de plus de douze mois, avoir présenté un titre brucellique inférieur à 30 unités internationales agglutinantes par millilitre lors d'une séroagglutination ou un titre brucellique inférieur à 20 unités internationales de Fixation du Complément par ml d'une épreuve de fixation du complément ou une réaction négative d'une épreuve à l'antigène brucellique tamponné ou d'un ELISA, effectué dans les 30 jours précédant la sortie du troupeau, et conformément aux dispositions de l'annexe 2.

Les tests visés ci-dessus ne sont pas nécessaires si les animaux proviennent d'une partie de territoire du Royaume reconnu officiellement indemne de brucellose ou faisant partie d'un réseau de surveillance reconnu.

Lorsqu'un des tests mentionnés ci-dessus est utilisé à des fins de certification, le test est indiqué dans la colonne "test" des tableaux figurant au point 3 de la section A, deuxième tiret, et au point 5 de la section A de l'annexe F, modèle 1 en application de la directive 64/432/CEE. ».

Art. 5.Le présent arrêté entre en vigueur le jour de sa publication au Moniteur belge.

Art. 6.Notre ministre qui a la santé publique dans ses attributions est chargé de l'exécution du présent arrêté.

Donné à Bruxelles, 21 décembre 2006.

ALBERT Par le Roi : Le Ministre des Affaires sociales et de la Santé publique, R. DEMOTTE

Annexe Ire Statut sanitaire des troupeaux A. Par troupeau avec statut sanitaire B1, on entend : un troupeau dans lequel les antécédents cliniques et la situation quant à la vaccination et au statut sérologique sont inconnus.

B. Par troupeau avec statut sanitaire B2, on entend : un troupeau dans lequel les antécédents cliniques, la situation quant à la vaccination et au statut sérologique sont connus et dans lequel des épreuves de contrôle de routine sont effectuées conformément au point C pour amener ce troupeau bovin au statut sanitaire de type B3 (indemne de brucellose) ou B4 (officiellement indemne de brucellose).

C. Par troupeau avec statut sanitaire B3 ou indemne de brucellose, on entend : un troupeau : a) dans lequel il ne se trouve aucun bovin mâle ayant été vacciné contre la brucellose;b) dans lequel toutes les femelles de l'espèce bovine ou une partie d'entre elles, ont été vaccinées : - à l'âge de six mois au plus à l'aide du vaccin vivant Buck 19 ou d'un autre vaccin agréé par la Communauté européenne; - à l'âge de quinze mois au plus, à l'aide du vaccin tué adjuvé 45/20 contrôlé et reconnu officiellement, c) dans lequel tous les bovins satisfont aux conditions indiquées au point D, b) et c), étant entendu que les bovins vaccinés à l'aide du vaccin vivant Buck 19, âgés de moins de trente mois, peuvent présenter un titre brucellique égal ou supérieur à 30 U.I. agglutinantes par millilitre mais inférieur a 80 U.I. agglutinantes par millilitre pour autant qu'il, présentent lors de la réaction de fixation du complément : - un titre inférieur à 30 unités CE, s'il s'agit de femelles vaccinées depuis moins de douze mois; - un titre inférieur à 20 unités CE dans tous les autres cas.

Les épreuves de séro-agglutination visées au point D, c), i), peuvent être remplacées par des épreuves de micro-agglutination ou des épreuves Elisa, effectuées conformément à l'annexe II; d) dans lequel aucun bovin n'a été introduit sans l'attestation d'un vétérinaire agréé certifiant : - qu'il se trouve dans les conditions prévues au point D, d), ou qu'il provienne d'un troupeau avec statut sanitaire B3 ou indemne de brucellose, et dans ce cas, s'il est âgé de douze mois ou plus, qu'il a présenté, dans les trente jours avant l'introduction dans le troupeau, selon les dispositions de l'annexe Il, un titre brucellique inférieur à 30 U.I. agglutinantes par millilitre et une réaction de fixation du complément négative.

Toutefois, s'il s'agit d'un bovin vacciné âgé de moins de trente mois, il peut présenter un titre brucellique égal ou supérieur à 30 U.I. agglutinantes par millilitre, mais inférieur à 80 U.I. agglutinantes par millilitre, pour autant qu'il présente, lors de la réaction de fixation du complément : - un titre inférieur à 30 unités CE, s'il s'agit d'un bovin femelle vacciné depuis moins de douze mois, - un titre inférieur à 20 unités CE après le douzième mois suivant la vaccination.

D. Par troupeau avec statut sanitaire B4 ou troupeau officiellement indemne de brucellose, on entend un troupeau : a) dans lequel ne se trouvent pas de bovins vaccinés contre la brucellose, à moins qu'il ne s'agisse de femelles ayant été vaccinées depuis au moins trois ans;b) dans lequel tous les bovins sont exempts de signes cliniques de brucellose depuis six mois au moins; c) dans lequel tous les bovins âgés de vingt-quatre mois ou plus : i) - ont présenté, à l'occasion de 2 séro-agglutinations pratiquées officiellement à des intervalles de trois mois au moins et de douze mois au plus selon les dispositions de l'annexe 2 de cet arrêté, un titre brucellique inférieur à 30 U.I. agglutinantes par millilitre; - la première séro-agglutination peut être remplacée par trois épreuves de l'anneau (ringtest). Celles-ci seront effectuées à intervalle de trois mois, à la condition toutefois que la seconde séro-agglutination sera effectuée six semaines au moins après la troisième épreuve de l'anneau; - ces épreuves de séro-agglutination peuvent être remplacées par deux épreuves de micro-agglutination ou 2 Elisa, effectuées conformément à l'annexe II et effectuées à intervalle de trois mois au moins et de douze mois au plus; ii) - sont contrôlés annuellement pour déterminer l'absence de brucellose par trois épreuves de l'anneau, effectuées à des intervalles d'au moins trois mois, ou deux épreuves de l'anneau sur échantillon de lait, effectuées à des intervalles d'au moins trois mois, et une épreuve sérologique (épreuve de séro-agglutination, épreuve à l'antigène brucellique tamponné, épreuve de plasmo-agglutination, épreuve de l'anneau de lait sur plasma sanguin, épreuve de micro-agglutination ou épreuve Elisa individuelle sur le sang), pratiquée six semaines au moins après la deuxième épreuve de l'anneau.

Lorsque les épreuves de l'anneau sur échantillon de lait ne sont pas pratiquées, deux épreuves sérologiques (épreuve de séro-agglutination, épreuve à l'antigène brucellique tamponné, épreuve de plasmo-agglutination, épreuve de l'anneau de lait sur plasma sanguin, épreuve de micro-agglutination ou épreuve Elisa individuelle sur le sang) sont effectuées chaque année à des intervalles de trois mois au moins ou de six mois au plus.

Lorsque, dans tout le Royaume ou dans une région du Royaume où la totalité des troupeaux bovins est soumise aux opérations officielles de lutte contre la brucellose, le pourcentage des troupeaux bovins infectés n'est pas supérieur à un, il suffit de procéder annuellement à deux épreuves de l'anneau à des intervalles d'au moins trois mois, ou à une épreuve sérologique (épreuve de séro-agglutination, épreuve à l'antigène brucellique tamponné, épreuve de plasmo-agglutination, épreuve de l'anneau de lait sur plasma sanguin, épreuve de micro-agglutination ou épreuve Elisa individuelle sur le sang); - En cas de contrôle sur le lait de citerne, le nombre des épreuves de l'anneau visées aux alinéas précédents est à doubler, les intervalles étant réduits de moitié; iii) il peut être renoncé aux exigences concernant le contrôle annuel de l'absence de brucellose prévu sous ii) lorsque au moins 99,80 % des troupeaux bovins sont reconnus officiellement indemnes de brucellose depuis quatre ans au minimum, Dans ce cas l'intervalle entre les contrôles à l'aide de l'une des épreuves sérologiques citées sous ii), peut être porté à trois ans.

La sélection des troupeaux qui font l'objet d'un examen sérologique se fait par l'Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaine Alimentaire.

Après une évaluation régulière de la situation épidémiologique, l'Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire organise un examen sanguin annuel de bovins importés provenant de pays tiers ou d'états membres non-officiellement indemnes de brucellose pendant trois années consécutives.

Cet examen est réalisé au moyen d'un test de micro-agglutination et d'un Elisa pendant trois années consécutives. d) dans lequel aucun bovin n'a été introduit sans qu'une attestation d'un vétérinaire agréé ne certifie que ce bovin provient d'un troupeau avec statut sanitaire B4 ou officiellement indemne de brucellose et, s'il est âgé de douze mois au plus, qu'il a présenté un titre brucellique inférieur à 30 U.I. agglutinantes par millilitre, lors d'une séro-agglutination pratiquée selon les dispositions de l'annexe 2, dans les trente jours avant l'introduction dans le troupeau; i) toutefois, la séro-agglutination peut ne pas être exigée quand le pourcentage de foyers n'est pas, depuis deux ans au moins, supérieur à 0,2 et s'il résulte d'une attestation d'un vétérinaire agréé que le bovin : 1.est dûment identifié; 2. provient d'un troupeau avec statut sanitaire B4 ou officiellement indemne de brucellose;3. n'est pas entré en contact, à l'occasion de son transport, avec des bovins ne provenant pas de troupeaux avec statut sanitaire B4 ou officiellement indemnes; ii) l'attestation prévue sous i) peut ne pas être exigée quand depuis quatre ans au minimum : - 99,80 % au moins des troupeaux ont le statut sanitaire B4 ou sont reconnus officiellement indemnes de brucellose et, - les troupeaux qui n'ont pas le statut sanitaire B4 ou qui ne sont pas officiellement indemnes se trouvent sous contrôle officiel, le transfert des bovins hors de ces troupeaux étant interdit, sauf s'ils sont conduits à l'abattage sous le couvert d'un sauf-conduit délivré par l'inspecteur vétérinaire.

Vu pour être annexe à Notre arrêté 21 décembre 2006 modifiant l'arrêté royal du 6 décembre 1978 relatif à la lutte contre la brucellose bovine et l'arrêté royal du 30 avril 1999 relatif au>. conditions de police sanitaire régissant les échanges intracommunautaires de bovins et de porcins.

ALBERT Par le Roi : Le Ministre des Affaires sociales et de la Santé publique, R. DEMOTTE

Annexe II Epreuves biologiques identification de l'agent 1. IDENTIFICATION DE L'AGENT La démonstration par coloration acido-résistante modifiée ou immunospécifique de la présence d'organismes ayant la morphologie de Brucella dans des matières abortives, des sécrétions vaginales ou du lait, indique la possibilité de brucellose, notamment lorsqu'elle est corroborée par des tests sérologiques. Après avoir isolé les micro-organismes, l'espèce et le biovar doivent être identifiés par lyse de phages et/ou des tests du métabolisme oxydatif seIon des critères culturaux, biochimiques et sérologiques.

Les techniques et les moyens utilisés, leur standardisation et l'interprétation des résultats doivent être conformes aux indications figurant dans le Manuel des normes de l'OIE pour les tests de diagnostic et les vaccins, quatrième édition, 2000, chapitre 2.3.1 (brucellose bovine), chapitre 2.4.2. (brucellose caprine et ovine) et chapitre 2.6.2. (brucellose porcine). 2 TESTS IMMUNOLOGIQUES 2.1 Normes 2.1.1. La souche n° 99 de Weybridge ou la souche USDA 1119-3 du biovar 1 de Brucella abortus doit être utilisée pour la préparation de tous les antigènes employés dans le test au rose bengale, l'épreuve de séro-agglutination, l'épreuve de fixation du complément et l'épreuve de l'anneau sur le lait. 2.1.2. Le sérum étalon pour les tests susmentionnés est le sérum étalon international de l'OIE (OIEISS) antérieurement dénommé second sérum étalon international anti-Brucella abortus de l'OMS. 2.1.3. Les sérums étalons pour les tests ELISA sont les suivants - Le sérum étalon de référence international de l'OIE (OIEISS), - le sérum étalon ELISA faiblement positif de l'OIE (OIEELISAWPSS), - le sérum étalon ELISA fortement positif de l'OEI (OIEELISASPSS), - le sérum étalon ELISA négatif de l'OIE (OIEELISANSS). 2.1.4. Les sérums étalons énumérés ci-dessus sont fournis par l'Agence des laboratoires vétérinaires [« Veterinary Laboratories Agency (VLA) », de Weybridge - Royaume-Uni)] 2.1.5. Les OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS, OIEELISANSS sont des étalons primaires internationaux à partir desquels des étalons secondaires nationaux (« étalons de travail ») doivent être établis pour chaque test. 2.2. Epreuve d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) ou autres épreuves d'agglutination destinées à la détection de la brucellose bovine dans le sérum ou le lait. 2.2. I. Matériel et réactifs La technique utilisée et l'interprétation des résultats doivent avoir été validées conformément aux principes établis au chapitre 1.1.3. de la quatrième édition 2000 du Manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE et doivent comprendre au minimum des études de laboratoire et de diagnostic. 2.2.2. Standardisation de l'épreuve 2.2.2.1. Standardisation de la procédure de test pour les échantillons individuels de sérum : a) une prédilution de l'OIEISS au 1/150 (1) ou une prédilution de l'OIEELISAMWPSS au 1/2 ou une prédilution de l'OIEELISASPSS au 1/16 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) doit produire une réaction positive;b) une prédilution du sérum OIEISS au 1/600 ou une prédilution du sérum OIEELISAWPSS au 1/8 ou une prédilution de l'OIEELISASPSS au 1/64 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) doit produire une réaction négative;c) l'OIEELISANSS doit dans tous les cas produire une réaction négative. 2.2.2.2. Standardisation de la procédure de test pour les échantillons de sérums en mélange : a) une prédilution de l'OIEISS au 1/150 ou une prédilution de l'OIEELISAMWPSS au 1/2 ou une prédilution de l'OIEELISASPSS au 1/16 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) et à nouveau diluée dans des sérums négatifs avec un facteur de dilution identique au nombre de sérums constituant le mélange doit produire une réaction positive;b) l'OIEELISANSS doit dans tous les cas produire une réaction négative;c) le test doit être en mesure de détecter la présence d'une infection chez un seul animal du groupe d'animaux dont des échantillons de sérums constituent le mélange. 2.2.2.3. Standardisation de la procédure de test pour les mélanges de lait ou de lactosérum : a) une prédilution de l'OIEISS au 1/1 000 ou une prédilution de l'OIEELISAWPSS au 1/16 ou une prédilution de l'OIEELISASPSS au 1/125 réalisée dans un sérum négatif (ou dans un mélange de sérums négatifs) et diluée à nouveau au 1/10 dans du lait négatif doit produire une réaction positive, b) l'OIEELISANSS dilué au 1/10 dans du lait négatif doit produire dans tous les cas une réaction négative;c) le test doit être en mesure de détecter la présence d'une infection chez un seul animal du groupe d'animaux dont les échantillons de lait ou de lactosérum constituent le mélange. 2.2.3. Conditions d'utilisation. des tests ELISA dans le diagnostic de la brucellose bovine 2.2.3.1. Si l'on utilise les conditions d'étalonnage susmentionnées pour les tests ELISA sur des échantillons de sérum, la sensibilité diagnostique de l'ELISA doit être égale ou supérieure à celle du test au rose bengale ou de l'épreuve de fixation du complément compte tenu de la situation épidémiologique dans laquelle l'épreuve est utilisée. 2.2.3.2. Si l'on utilise les conditions de standardisation susmentionnées pour l'ELISA sur des échantillons de lait de mélange, la sensibilité diagnostique de l'ELISA doit être égale ou supérieure à celle de l'épreuve de l'anneau sur le lait compte tenu non seulement de la situation épidémiologique mais également des effectifs moyens ou élevés des élevages considérés. 2.2.3.3. Lorsque les tests ELISA sont utilisés à des fins de certification conformément à la Directive 64/432/CEE, article 6, paragraphe 1, ou pour l'établissement et le maintien du statut d'un troupeau conformément à la Directive 64/432/CEE, annexe A, titre II, point 10, le mélange d'échantillons de sérum doit être effectué de manière à ce que les résultats des tests puissent être rapportés de manière indiscutable aux différents animaux inclus dans le mélange.

Tout test de confirmation doit être effectué sur des échantillons de sérum individuels. 2.2.3.4. Les tests ELISA peuvent être appliqués à un échantillon de lait prélevé sur le lait collecté dans une exploitation comptant au moins 30 % de vaches en période de lactation. Si cette méthode est utilisée, des mesures doivent être prises afin que les échantillons prélevés pour être examinés puissent être rapportés de manière indiscutable aux différents animaux dont provient le lait. Tout test de confirmation doit être effectué sur des échantillons de sérum individuels. 2.3. Test de fixation du complément (TFC) 2.3.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline phénolée [NaCI à 0.85 % (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)] ou dans du tampon véronal. Les antigènes peuvent être livrés à l'état concentré pour autant que le facteur de dilution à utiliser soit mentionné sur l'étiquette du flacon. L'antigène doit être stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé. 2.3.2. les sérums doivent être inactivés de la manière suivante : - sérum bovin : à une température de 56 à 60 °C pendant 30 à 50 minutes, - sérum porcin : à une température de 60 °C pendant 30 à 50 minutes. 2.3.3. Afin d'obtenir une réaction satisfaisante, il convient d'utiliser une dose de complément supérieure à la dose minimale nécessaire pour une hémolyse complète. 2.3.4. Les contrôles suivants doivent être effectués lors de chaque série d'épreuves de fixation du complément : a) contrôle du pouvoir anti complémentaire du sérum;b) contrôle de l'antigène;c) contrôle des hématies sensibilisées;d) contrôle du complément;e) contrôle à l'aide d'un sérum positif de la sensibilité au déclenchement de la réaction;f) contrôle de la spécificité de la réaction à l'aide d'un sérum négatif. 2.3.5. Calcul des résultats : L'OIEISS contient 1 000 unités internationales de FC (UIFC) par ml. Si l'OIEISS est testé dans une méthode donnée, le résultat est exprimé sous la forme d'un titre (TOIEISS). Le résultat de l'épreuve pour un sérum exprimé sous la forme de titre (TTESTSERUM) doit être converti eu UIFC par ml. De manière à convertir l'expression d'un titre en UIFC, le facteur (F) nécessaire à la conversion du titre d'un sérum inconnu (TTESTSERUM) éprouvé au moyen de cette méthode est obtenu au moyen de la formule suivante : F = 1 000 x 1/TOIEISS Et le contenu en UIFC par ml du sérum (UIFCTESTSERUM) par la formule UIFCTESTSERUM = F x TTESTSERUM 2.3.6. Interprétation des résultats Un sérum contenant 20 ou plus d'UIFC par ml est considéré comme positif. 2.4. Epreuve de l'anneau sur le lait 2.4.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline phénolée [NaCI à 0,85 % (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)] colorée à l'hématoxyline. L'antigène doit être stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé. 2.4.2. La sensibilité de l'antigène doit être étalonnée par rapport au sérum étalon OIEISS de manière à obtenir une réaction positive avec une dilution du 1/500 de ce sérum étalon dans du lait négatif et une réaction négative à une dilution du 1/1 000 de ce même sérum. 2.4.3. L'épreuve de l'anneau doit être effectuée sur des échantillons représentatifs du contenu de chaque bidon de lait ou du contenu de chaque tank de l'exploitation. 2.4.4. Les échantillons de lait ne doivent pas avoir été congelés, chauffés ni violemment agités. 2.4.5. la réaction doit être réalisée en utilisant l'une des méthodes suivantes : - sur une colonne de lait d'au moins 25 mm de hauteur et un volume de lait de 1 ml additionné de 0,03 ou 0,05 ml d'un antigène coloré et titré. - sur une colonne de lait d'au moins 25 mm de hauteur et un volume de lait de 2 ml additionné de 0,05 ml d'un antigène coloré et titré, - sur un volume de lait de 8 ml additionné de 0,08 ml d'un antigène coloré et titré. 2.4.6. Le mélange de lait et d'antigène doit être incubé à 37 °C pendant 60 minutes et l'épreuve doit être effectuée parallèlement sur des laits de contrôle positif et négatif. La sensibilité de l'épreuve est améliorée si l'incubation est prolongée à 4 °C durant une période de 16 à 24 heures. 2.4.7. Interprétation des résultats a) réaction négative : lait coloré, crème non colorée;b) réaction positive : - lait et crème colorés de façon identique, ou - lait non coloré et crème colorée. 2.5. Epreuve sur lame au rose bengale (RB) 2.5.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans un diluant d'antigène de Brucella tamponné à pH 3,65 + 0,05 colorée au rose bengale. L'antigène doit être livré prêt à l'emploi, stocké à une température de 4 °C et ne doit pas être congelé. 2.5.2. L'antigène est préparé sans référence à la concentration cellulaire, mais sa sensibilité doit être étalonnée par rapport à l'OIEISS de manière à obtenir une réaction positive pour une dilution de sérum de 1/45 et une réaction négative pour une dilution du 1/55. 2.5.3. Le test RB est réalisé de la manière suivante : a) Une goutte de sérum (20-30 µl) est mélangé avec un volume égal d'antigène sur un carreau blanc ou une plaque émaillée pour produire une zone d'un diamètre de 2 cm environ.Le mélange est agité délicatement pendant 4 minutes à la température ambiante puis est observé sous un bon éclairage pour visualiser toute agglutination; b) une méthode automatisée peut être utilisée pour lutant qu'elle soit au moins aussi sensible et exacte que la méthode manuelle. 2.5.4. Interprétation. des résultats Toute réaction visible est considérée comme positive à moins que le séchage ne soit excessif sur les bords.

Des sérums de contrôle positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque série d'épreuves. 2.6. Epreuve de séro-agglutination 2.6.1. L'antigène consiste en une suspension bactérienne dans une solution saline au phénol [NaCI à 0,85 % (m/v) et phénol à 0,5 % (v/v)]. Le formaldéhyde ne doit pas être utilisé.

L'antigène peut être livré à l'état concentré pour autant que le facteur de dilution à utiliser soit mentionné sur l'étiquette du flacon.

De l'EDTA peut être ajouté à la suspension d'antigène jusqu'à l'obtention d'une dilution finale d'épreuve de 5 mM afin de réduire le taux de réactions faussement positives dans l'épreuve de séro-agglutination. Le pH doit ultérieurement être réajusté à 7,2 dans la suspension d'antigène. 2.6.2. L'OIEISS contient 1 000 unités internationales d'agglutination. 2.6.3. L'antigène est préparé sans référence à la concentration cellulaire mais sa sensibilité doit être étalonnée par rapport à POIEISS de manière à obtenir une agglutination de 50 % pour une dilution finale du sérum entre le 1/600 et le 1/1 000 ou une agglutination de 75 % pour une dilution finale du sérum entre le 1/500 et le 1/750.

Il peut également être utile de comparer la réactivité de nouveaux lots d'antigène et des lots d'antigène étalonnés antérieurement en utilisant un groupe de sérum définis. 2.6.4. Le test est effectué dans des tubes ou sur des microplaques. Le mélange d'antigène et de dilution de sérum doit être incubé pendant une durée : de 16 à 24 heures à une température de 37° C. Trois dilutions au moins doivent être préparées pour chaque sérum. Les dilutions de sérum suspect doivent être effectuées de manière à ce que la lecture de la réaction à la limite de la positivité (30 UI/ml) soit réalisée dans le tube intermédiaire (ou le puits intermédiaire pour le méthode des microplaques). 2.6.5. Interprétation des résultats Le degré d'agglutination de Brucella dans un sérum doit être exprimé en unités internationales (UI) par ml.

Un sérum contenant 30 UI par ml ou plus est considéré comme positif. 3. TESTS COMPLEMENTAIRES 3.1. Test cutané de la brucellose 3.1.1. Conditions d'utilisation du test a) Le test cutané de la brucellose ne peut être utilisé à des fins de certification dans les échanges intracommunautaires.b) Le test cutané de la brucellose est l'une des épreuves les plus spécifiques pour la détection de la brucellose chez les animaux non vaccinés;le diagnostic ne doit toutefois pas reposer sur des réactions intradermiques positives. c) Les animaux de l'espèce bovine ayant produit un résultat négatif à l'un des tests sérologiques définis à la présente annexe et une réaction positive au test cutané de la brucellose sont considérés comme infectés.d) Les animaux de l'espèce bovine ayant donné un résultat positif à l'un des tests sérologiques définis à la présente annexe peuvent être soumis à un test cutané de la brucellose afin de confirmer l'interprétation des résultats des tests sérologiques notamment quand une réaction croisée avec des anticorps dirigés contre d'autres bactéries ne peut être exclue dans le cas des troupeaux indemnes ou officiellement indemnes de brucellose. 3.1.2. L'épreuve doit être effectuée en utilisant une préparation allergénique standardisée et définie ne contenant : pas d'antigène lipopolyosidique (LPS) lisse, celui-ci pouvant provoquer des réactions inflammatoires non spécifiques ou interférer avec des tests sérologiques ultérieurs.

L'une de ces préparations est la brucellone INRA provenant d'une souche non lisse de B.melitensis. Les conditions de sa production sont décrites en détail à la section B2 du chapitre 2.4.2 du Manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE, quatrième édition, 2000. 3.1.3. Procédure du test 3.1.3.1. Un volume de 0,1 ml d'allergène de la brucellose est injecté par voie intradermique au pli caudal, au flanc ou sur le côté de l'encolure. 3.1.3.2. Le test est lu au bout de 48 à 72 heures. 3.1.3.3. Avant l'injection et lors du réexamen, l'épaisseur de la peau au site d'injection est mesurée avec un cutimètre. 3.1.3.4. Interprétation des résultats Les réactions fortes sont facilement identifiables en raison d'une inflammation et d'une induration locales. Un épaississement de la peau de 1,5 à 2 mm est considéré comme réaction positive au test cutané de la brucellose. 3.2. Test d'immuno-absorption enzymatique de compétition (cELISA) 3.2.1. Conditions d'utilisation du test cELISA a) le test cELISA ne peut pas être utilisé à des fins de certification dans les échanges intracommunautaires.b) Le test cELISA a été démontré comme plus spécifique que par exemple le test ELISA indirect et peut ainsi être utilisé pour aider à l'interprétation de résultats de tests sérologiques. 3.2.2. Procédure du test Le test sera mis en oeuvre selon les prescriptions du chapitre 2.3.1 (2) (a) du manuel des normes de l'OIE pour les tests de diagnostic et les vaccins, quatrième édition, 2000. 4. LABORATOIRES NATIONAUX DE REFERENCF, 4.1. Tâches et responsabilités Les tâches du laboratoire national de référence sont les suivantes : a) approbation des résultats des études de validation démontrant la fiabilité de la méthode de test utilisé dans l'Etat membre;b) détermination du nombre maximal d'échantillons pouvant constituer un mélange dans les kits ELISA utilisés; c) étalonnage des sérums étalons nationaux secondaires (« étalons de travail ») par rapport au sérum étalon primaire international visé au paragraphe 2.1; d) contrôle de la qualité de tous les lots de kits ELISA et d'antigènes utilisés dans le Royaume;e) coopération au sein du réseau des laboratoires nationaux de référence de la Communauté européenne pour la brucellose;f) collecte et typage systématique des souches, ainsi que leur centralisation et archivage;g) confirmation des tests sérologiques et bactériologiques positifs;h) organisation et définition des ring tests;i) suivi de l'évolution de la situation épidémiologique dans les autres pays;j) tâches de coordination technique. 4.2. Laboratoire national de référence Centre d'études et de recherches vétérinaires et agrochimiques (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B - 1180 Bruxelles Vu pour être annexe à Notre arrêté royal 21 décembre 2006 modifiant l'arrêté royal du 6 décembre 1978 relatif à la lutte contre la brucellose bovine et l'arrêté royal du 30 avril 1991 relatif aux conditions de police sanitaire régissant les échanges intracommunautaires de bovins et de porcins.

ALBERT Par le Roi : Le Ministre des Affaires sociales et de la Santé publique, R. DEMOTTE _______ Notes (1) Aux fins de la présente annexe, les dilutions indiquées pour la préparation des réactifs liquides sont exprimées par exemple comme 1/150, c'est-à-dire une dilution de 1 pour 150.