26 JANUARI 2014. - Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.)

FILIP, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet.

Gelet op de Grondwet, artikel 108;

Gelet op de wet van 2 april 1971 betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen, artikel 2, § 1, 1, 4, 5 en 8, gewijzigd bij de wet van 5 februari 1999 en bij het koninklijk besluit van 22 februari 2001 en § 2, gewijzigd bij de wet van 27 december 2004;

Gelet op de wet van 4 februari 2000 houdende oprichting van het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen, artikel 4, §§ 1 en 2, § 3, gewijzigd bij de wet van 22 december 2003, en artikel 5, tweede lid, 7°, gewijzigd bij de wet van 22 december 2003;

Gelet op het ministerieel besluit van 30 augustus 1999 betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.;

Gelet op het ministerieel besluit van 14 februari 2000 tot vaststelling van maatregelen om te beletten dat Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. zich verspreidt;

Gelet op het overleg tussen de gewestregeringen en de federale overheid van 23 mei 2013;

Gelet op het voorafgaand onderzoek met betrekking tot de noodzaak om een duurzame ontwikkelingseffectbeoordeling uit te voeren zoals bepaald in artikel 19/1 van de wet van 5 mei 1997 betreffende de coördinatie van het federale beleid inzake duurzame ontwikkeling, waaruit blijkt dat een effectbeoordeling in dit geval niet vereist is aangezien dit besluit de omzetting is van een richtlijn van de Europese Unie bedoeld in artikel 2, 3° van het koninklijk besluit van 20 september 2012 tot uitvoering van artikel 19/1, § 1;

Gelet op het advies 54.368/1 van de Raad van State, gegeven op 25 november 2013, bij toepassing van art. 84, § 1, eerste lid, 1°, van de wetten op de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973, Op voordracht van de Minister van Landbouw, Hebben Wij besloten en besluiten Wij : HOOFDSTUK 1. - Omzetting

Artikel 1.Dit besluit is de gedeeltelijke omzetting van richtlijn 98/57/EG van de Raad van 20 juli 1998 betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. HOOFDSTUK 2. - Definities

Art. 2.Voor de toepassing van dit besluit wordt verstaan onder : a) "het Agentschap" : het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen; b) "het organisme" : de voor bruinrot verantwoordelijke ziekteverwekker Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., vroeger bekend als Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; c) "het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal" : de in bijlage I, deel I, bij dit besluit vermelde waardplanten van het organisme;d) "het koninklijk besluit van 10 augustus 2005" : het koninklijk besluit van 10 augustus 2005 betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. HOOFDSTUK 3. - Toezicht

Art. 3.§ 1. Het Agentschap verricht ieder jaar systematisch officiële onderzoeken voor het opsporen van het organisme op het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat afkomstig is van het Belgische grondgebied. Met het oog op de identificatie van mogelijke andere besmettingsbronnen die een bedreiging vormen voor de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, voert het Agentschap in de productiegebieden van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal een risicobeoordeling uit en, als daaruit een risico op verspreiding van het organisme naar voren komt, voert het gerichte officiële onderzoeken uit naar het organisme op andere planten dan het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, inclusief in het wild voorkomende waardplanten van de nachtschadefamilie, alsmede zowel in het oppervlaktewater dat wordt gebruikt voor beregening of bespuiting van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, als in het afvalwater dat wordt geloosd door industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven die in de lijst opgenomen plantaardig materiaal behandelen en dat wordt gebruikt voor beregening of bespuiting van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal. De omvang van die gerichte onderzoeken wordt aan de hand van het vastgestelde risico bepaald.

Het Agentschap kan eveneens officiële onderzoeken doen ter opsporing van het organisme op ander materiaal, zoals groeimedium, grond en vast afval van industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven. § 2. De in paragraaf 1 bedoelde officiële onderzoeken worden als volgt uitgevoerd : a) voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, volgens de in bijlage I, deel II vermelde criteria;b) voor andere waardplanten dan het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en voor water, inclusief afvalwater, overeenkomstig daartoe geëigende methoden, waarbij, in voorkomend geval, monsters worden genomen waarop tests worden gedaan in officiële laboratoria of onder officieel toezicht;c) waar nodig, voor ander materiaal : overeenkomstig de daartoe geëigende methoden. Op basis van gefundeerde wetenschappelijke en statistische beginselen en van de biologische kenmerken van het organisme en rekening houdend met de bijzondere productiesystemen voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en, desgevallend, voor andere waardplanten van het organisme, legt het Agentschap de te volgen inspectieprocedures vast alsook waar, op welk tijdstip en hoeveel monsters moeten worden genomen en de samenstelling van de steekproef. HOOFDSTUK 4. - Vermoeden van besmetting

Art. 4.§ 1. Bij elke vermoede aanwezigheid van het organisme voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal ziet het Agentschap toe op de volledige afwikkeling van officiële of onder officieel toezicht verrichte laboratoriumtests volgens de in bijlage II beschreven relevante methode en conform de voorwaarden beschreven in bijlage III, punt 1 of, in alle andere gevallen volgens om het even welke andere officieel erkende methode met als doel die aanwezigheid te bevestigen of te ontkennen. Als de aanwezigheid van het organisme wordt bevestigd, zijn de bepalingen van bijlage III, punt 2, van toepassing. § 2. In afwachting van de bevestiging of de ontkenning van de in paragraaf 1 bedoelde vermoede aanwezigheid : a) is het verkeer van planten en knollen van alle gewassen, partijen of zendingen waarvan de monsters zijn genomen, verboden, tenzij onder toezicht van het Agentschap en op voorwaarde dat vaststaat dat er geen aanwijsbaar risico is dat het organisme zich kan verspreiden;b) treft het Agentschap de maatregelen die nodig zijn om de oorsprong van de vermoede aanwezigheid van het organisme te achterhalen;c) stelt het Agentschap, met name voor de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en het verkeer van andere pootaardappelpartijen dan die bedoeld in a), die geteeld zijn op de productieplaats waar de in a) bedoelde monsters werden genomen, passende aanvullende, op de geraamde risicograad gesteunde voorzorgsmaatregelen in om elke verspreiding van het organisme te voorkomen. Het vorige lid is alleen van toepassing telkens wanneer a) diagnostische visuele symptomen zijn vastgesteld die de aanwezigheid doen veronderstellen van de door het organisme veroorzaakte ziekte alsook een positieve reactie op de in bijlage II, deel I, punt 1, en deel II nader omschreven snelle opsporingstest(s), of b) een positieve reactie werd vastgesteld op de in bijlage II, deel I, punt 2, en deel III nader omschreven opsporingstest(s). § 3. Indien bij vermoede aanwezigheid van het organisme een risico bestaat voor besmetting van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal of het oppervlaktewater vanuit of naar een andere lidstaat, stelt het Agentschap de andere betrokken lidstaat of lidstaten onverwijld en al naargelang van het vastgestelde risico in kennis van de gegevens met betrekking tot die vermoede aanwezigheid. HOOFDSTUK 5. - Bevestiging van de besmetting

Art. 5.§ 1. Wanneer de officiële of onder officieel toezicht verrichte laboratoriumtests waarbij de in bijlage II beschreven relevante methode of, in alle overige gevallen, enige andere officieel erkende methode werd toegepast, de aanwezigheid van het organisme in het overeenkomstig dit besluit genomen monster bevestigen : a) als het gaat om in de lijst opgenomen plantaardig materiaal : i) stelt het Agentschap een onderzoek in om de omvang en de primaire bron(nen) van de besmetting te bepalen, overeenkomstig het bepaalde in bijlage IV en aan de hand van bijkomende tests overeenkomstig artikel 4, § 1, op ten minste alle voorraden van klonaal verwante pootaardappelen, en ii) verklaart het Agentschap besmet : 1° het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, de zending en/of de partij waarvan het monster is genomen, alsmede de machines, het voertuig, de container, de opslagplaats of delen daarvan, en enig ander voorwerp, inclusief de verpakkingen die in contact zijn geweest met het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal waarvan het monster werd genomen;2° indien van toepassing, het veld (de velden), de productie-eenheid (-eenheden) voor beschutte teelt en de productieplaats(en) waar het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal werd geoogst en waarvan het monster werd genomen;3° en voor de tijdens de groei genomen monsters, het(de) veld(en), de productieplaats(en) en, in voorkomend geval, de productie-eenheid (-eenheden) voor beschutte teelt waar het monster werd genomen, en iii) bepaalt het Agentschap, overeenkomstig het bepaalde in bijlage V, punt 1, de omvang van de waarschijnlijke besmetting hetzij door contact voor of na de oogst met besmet verklaarde elementen hetzij door verbanden met deze doorheen het productie-, beregenings- of bespuitingssysteem, hetzij door klonale verwantschap, en iv) bakent het Agentschap een zone af op basis van de in ii) bedoelde besmetverklaring, de in iii) bedoelde bepaling van de omvang van de waarschijnlijke besmetting en de mogelijke verspreiding van het organisme, overeenkomstig het bepaalde in bijlage V, punt 2, onder i);b) voor teelten van andere dan de in a) vermelde waardplanten en als de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal is geïdentificeerd als vatbaar voor een risico : i) stelt het Agentschap een onderzoek in overeenkomstig punt a), i), en ii) verklaart het Agentschap de waardplanten van het organisme, waarvan het monster werd genomen, besmet, en iii) bepaalt het Agentschap de omvang van de waarschijnlijke besmetting en bakent het een zone af overeenkomstig respectievelijk punt a), iii) en a) iv) ten aanzien van de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal;c) voor oppervlaktewater (inclusief de vloeibare effluenten van industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven die in de lijst opgenomen plantaardig materiaal behandelen) en daarbij horende in het wild groeiende waardplanten van de nachtschadefamilie en wanneer de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal is geïdentificeerd als vatbaar voor een risico door hetzij beregening, hetzij bespuiting of overstroming met oppervlaktewater : i) stelt het Agentschap een onderzoek in met inbegrip van een officieel onderzoek, op de daartoe geschikte tijdstippen, van monsters van oppervlaktewater en van eventueel aanwezige in het wild groeiende waardplanten van de nachtschadefamilie om de omvang van de besmetting te bepalen, en ii) verklaart het Agentschap, voor zover nodig en op grond van het in punt i) bedoelde onderzoek, het oppervlaktewater waarvan het monster is of de monsters zijn genomen, besmet, en iii) bepaalt het Agentschap de omvang van de waarschijnlijke besmetting op basis van de in ii) bedoelde besmetverklaring en de mogelijke verspreiding van het organisme, rekening houdend met het bepaalde in bijlage V, punt 1 en punt 2, ii). Voor de toepassing van a), b) en c) houdt het Agentschap rekening met gefundeerde wetenschappelijke beginselen, de biologische kenmerken van het organisme en de gebruikelijke bijzondere systemen voor de productie, het in de handel brengen en de verwerking van de waardplanten van het organisme. § 2. De Minister bakent de gebieden af op basis van de in paragraaf 1, c), bedoelde bepaling van de omvang van de besmetting. § 3. In aansluiting op de kennisgeving door een andere lidstaat, overeenkomstig de bepalingen van artikel 5, lid 2, van de voornoemde richtlijn 98/57/EG van de Raad van 20 juli 1998, van een besmetting waarbij België is betrokken gaat het Agentschap over tot een onderzoek, conform paragraaf 1, a) i) en, waar nodig, paragraaf 1, c) i) en onderneemt het Agentschap elke gepaste bijkomende actie overeenkomstig paragraaf 1. HOOFDSTUK 6. - Bijzondere bestrijdingsmaatregelen

Art. 6.§ 1. Het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, dat conform artikel 5, § 1, a), ii), besmet is verklaard, mag niet worden geplant en wordt onder toezicht van het Agentschap onderworpen aan één van de in bijlage VI, punt 1, vermelde bepalingen, zodat vast komt te staan dat er geen aanwijsbaar risico bestaat voor verspreiding van het organisme. § 2. Het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat conform artikel 5, § 1, a), iii), en c), iii) waarschijnlijk besmet is verklaard, met inbegrip van het in de lijst opgenomen materiaal waarvoor een risico is vastgesteld, dat is geproduceerd op productieplaatsen die waarschijnlijk besmet zijn verklaard conform artikel 5, § 1, a), iii), mag niet worden geplant en wordt onder toezicht van het Agentschap gebruikt of verwijderd op de in bijlage VI, punt 2, aangegeven adequate wijze zodat vast komt te staan dat er geen aanwijsbaar risico bestaat voor verspreiding van het organisme. § 3. Machines, voertuigen, recipiënten, opslagplaatsen of delen daarvan, en elk ander voorwerp, met inbegrip van verpakkingen, die conform artikel 5, § 1, a), ii), besmet zijn verklaard of die conform artikel 5, § 1, punt a), iii), en c), iii), waarschijnlijk besmet zijn verklaard, moeten volgens de in bijlage VI, punt 3, nader omschreven adequate methoden worden vernietigd of ontsmet. Die voorwerpen worden na ontsmetting niet langer als besmet beschouwd. § 4. Onverminderd de krachtens paragrafen 1, 2 en 3 genomen maatregelen, worden in de overeenkomstig artikel 5, § 1, a), iv), afgebakende zone diverse maatregelen toegepast, omschreven in bijlage VI, punten 4.1 en 4.2. en in bijlage VII. § 5. Onverminderd de krachtens paragrafen 1, 2 en 3 genomen maatregelen worden de in bijlage VI, punt 4.2 en in bijlage VII nader omschreven maatregelen toegepast in de conform artikel 5, § 2, afgebakende zone. § 6. Om elk aanwijsbaar risico van verspreiding van het organisme te voorkomen, gebeurt de verwijdering van afval met inachtneming van de voorwaarden die zijn vastgelegd in bijlage VII bij de voornoemde richtlijn 98/57/EG van de Raad van 20 juli 1998. HOOFDSTUK 7. - Teeltmateriaal

Art. 7.§ 1 Onverminderd hetgeen is bepaald in het koninklijk besluit van 10 augustus 2005 moeten pootaardappelen in rechte lijn afstammen van materiaal dat werd verkregen in het kader van een officieel goedgekeurd programma en dat vrij van het organisme werd verklaard in aansluiting op volgens de in bijlage II beschreven methode officieel of onder officieel toezicht uitgevoerde tests. § 2. De in paragraaf 1 bedoelde tests worden uitgevoerd : a) wanneer de vaststelling van het organisme werd bevestigd in de Belgische pootaardappelproductie : i) door middel van tests op de voorgaande generaties, met inbegrip van de oorspronkelijke kloonselectie, en van systematische tests op de klonen van basisaardappelpootgoed, of ii) wanneer de afwezigheid van klonale verwantschap werd aangetoond door tests op al de klonen van basisaardappelpootgoed of de voorgaande generaties, met inbegrip van de oorspronkelijke kloonselectie, b) in de overige gevallen hetzij op elke plant van de oorspronkelijke kloonselectie, hetzij op representatieve monsters van het basisaardappelpootgoed of van de voorgaande generaties. HOOFDSTUK 8. - Aanvullende maatregelen

Art. 8.De Minister kan aanvullende of strengere maatregelen vastleggen die vereist zijn om het organisme te bestrijden of om verspreiding ervan te voorkomen, voor zover die maatregelen in overeenstemming zijn met de bepalingen van het koninklijk besluit van 10 augustus 2005. HOOFDSTUK 9. - Opheffingsbepalingen

Art. 9.§ 1. Worden opgeheven : a) het ministerieel besluit van 30 augustus 1999 betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.b) artikelen 2 en 3 van het ministerieel besluit van 14 februari 2000 tot vaststelling van maatregelen om te beletten dat Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.zich verspreidt. HOOFDSTUK 1 0. - Uitvoeringsbepaling

Art. 10.De minister die bevoegd is voor de Veiligheid van de Voedselketen is belast met de uitvoering van dit besluit.

Gegeven te Brussel 26 januari 2014.

FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE

Bijlage I DEEL I. - Lijst van waardplanten van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. als bedoeld in artikel 2 Planten (met inbegrip van knollen) van Solanum tuberosum L., Aardappel met uitzondering van de eigenlijke zaden Planten van Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw., Tomaat met uitzondering van de zaden en de vruchten DEEL II. - Onderzoeken De officiële onderzoeken als bedoeld in artikel 3, § 2, onder a), steunen op de biologische eigenschappen van het organisme en op bijzondere specifieke productiesystemen en omvatten : i) voor aardappelen : a) op daartoe geschikte tijdstippen, een visuele inspectie van het gewas in de groeifase en/of een bemonstering van pootaardappelen en andere aardappelen tijdens de groei of de opslag;die monsters ondergaan een officiële of onder officieel toezicht uitgevoerde visuele inspectie op doorgesneden knollen, en b) voor pootaardappelen en, desgevallend, voor andere aardappelen, officiële of onder officieel toezicht volgens de in bijlage II beschreven methode uitgevoerde laboratoriumtests; ii) voor tomaten : a) een visuele inspectie, op daartoe geschikte tijdstippen, van ten minste het gewas in de groeifase van voor herplanten voor professioneel gebruik bestemd plantgoed. Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw Mevr. S. LARUELLE

Bijlage II Testsmethode voor de diagnose, detectie en identificatie van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

OVERZICHT VAN DE TESTSMETHODE Deze testsmethode beschrijft de verschillende procedures voor : i) de diagnose van bruinrot in aardappelknollen en aardappel- en, tomatenplanten en enkele andere waardplanten; ii) de detectie van Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) in monsters van aardappelknollen, aardappel- en tomatenplanten en andere waardplanten, water en grond; iii) de identificatie van R. solanacearum.

ALGEMENE BEGINSELEN In de aanhangsels worden geoptimaliseerde protocollen voor de verschillende methoden, gevalideerde reagentia, en nadere bijzonderheden betreffende de bereiding van analyse- en controlemateriaal beschreven. Aanhangsel 1 bevat een lijst van laboratoria die bij de optimalisering en validering van de protocollen zijn betrokken.

Aangezien de protocollen betrekking hebben op de detectie van een quarantaineorganisme en daarbij levensvatbare culturen van R. solanacearum als controlemateriaal gebruikt worden, moeten de procedures onder adequate quarantaineomstandigheden met de nodige faciliteiten voor afvalverwijdering worden uitgevoerd en moeten de officiële autoriteiten voor plantenquarantaine de vereiste vergunningen hebben verstrekt.

De testparameters moeten zodanig zijn dat R. solanacearum bij de drempelwaarden die voor de gekozen methoden zijn vastgesteld op consistente en reproduceerbare wijze gedetecteerd wordt.

Het is essentieel dat de positieve controlemonsters zorgvuldig bereid worden.

Om de tests met de vereiste drempelwaarden te kunnen verrichten moet verder de apparatuur juist ingesteld, in goede staat van onderhoud en geijkt zijn, moeten de reagentia zorgvuldig gehanteerd en bewaard worden en moeten alle maatregelen worden genomen om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen; zo moeten de positieve controlemonsters gescheiden van de analysemonsters bewaard worden. Er moeten kwaliteitsbewakingsnormen worden toegepast om administratieve en andere fouten te vermijden, met name bij de etikettering en documentatie.

Een vermoede aanwezigheid als bedoeld in artikel 4, lid 2, van richtlijn 98/57/EG betekent dat een positieve uitslag is verkregen bij een diagnostische of screeningstest op een monster zoals aangegeven in de stroomdiagrammen. Een positieve eerste screeningstest (IF, PCR/FISH, selectieve isolatie) moet met een tweede, op andere biologische principes gebaseerde screeningstest worden bevestigd.

Als de eerste screeningstest positief is, wordt besmetting met R. solanacearum vermoed en moet een tweede screeningstest worden uitgevoerd. Is de tweede screeningstest ook positief, dan wordt het vermoeden bevestigd (vermoede aanwezigheid) en moeten de tests volgens de testsmethode worden voortgezet. Als de tweede screeningstest negatief is, wordt aangenomen dat het monster niet met R. solanacearum besmet is.

Onder bevestigde aanwezigheid als bedoeld in artikel 5, lid 1, van richtlijn 98/57/EG wordt verstaan dat een reincultuur van R. solanacearum is geïsoleerd en geïdentificeerd en de pathogeniteit ervan bevestigd is.

DEEL I. - Toepassing van de testsmethode 1. Stroomdiagram voor de diagnose van bruinrot (R.solanacearum) in aardappelknollen en aardappel-, tomaten en andere waardplanten met symptomen van bruinrot De testprocedure is bedoeld voor aardappelknollen en -planten met symptomen die karakteristiek zijn voor bruinrot of een vermoeden daarvan doen rijzen. Ze omvat een snelle screeningstest, isolatie van het pathogeen uit geïnfecteerd vaatweefsel op een (selectief) medium en, in geval van een positieve uitslag, identificatie van de cultuur als R. solanacearum.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen Principe Deze testprocedure is bedoeld voor het opsporen van latente infecties in aardappelknollen. Een positieve uitslag bij ten minste twee, op verschillende biologische principes gebaseerde screeningstests (3) moet worden bevestigd door isolatie van het pathogeen. In geval van isolatie van karakteristieke kolonies wordt de procedure vervolgd door identificatie van een reincultuur als R. solanacearum. Een positieve uitslag bij slechts één van de screeningstests is niet voldoende om het monster als verdacht aan te merken.

Met de screenings- en isolatietests moet een detectiegrens worden gehaald van 103-104 cellen/ml van de geresuspendeerde pellet die als positieve controle aan elke testreeks wordt toegevoegd.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 3. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- of andere waardplanten

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld DEEL II. - Gedetailleerde beschrijving van de methoden voor de detectie van R. solanacearum in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot 1. Symptomen 1.1. Symptomen bij aardappel Aardappelplant. Het eerste infectiestadium uit zich in bladverwelking nabij de top van de plant bij hoge temperaturen overdag met herstel's nachts. Aanvankelijk blijven de bladeren groen, later vergelen ze en treedt bruine necrose op. Ook komt epinastie voor. De verwelking van scheuten of hele planten is al snel onomkeerbaar; de plant zakt ineen en sterft. Het vaatweefsel in dwars doorgesneden stengels van verwelkte planten ziet er doorgaans bruin uit en uit het snijvlak komt een melkachtig bacterieslijm (spontaan of als de stengel wordt dichtgeknepen). Wanneer een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, komen er slijmdraden uit de vaatbundels.

Aardappelknol. De aardappelknollen moeten dicht bij het naveleinde (stoloon) dwars of over de stoloon overlangs doorgesneden worden. Het eerste infectiestadium uit zich in een glazige gele tot lichtbruine verkleuring van de vaatbundelring, waaruit na enkele minuten spontaan roomkleurig bacterieslijm komt. Later wordt de vaatverkleuring duidelijker bruin en kan de necrose zich tot in het parenchym uitstrekken. In gevorderde stadia komt uit de navel en de ogen bacterieslijm waaraan bodemdeeltjes blijven hangen. Op de schil kunnen door instorting van onderliggend vaatweefsel roodbruine, iets verzonken laesies verschijnen. In gevorderde stadia van de ziekte komt secundair vaak zacht bacterieel of schimmelrot voor. 1.2. Symptomen bij tomaat Tomatenplant. Het eerste zichtbare symptoom is dat de jongste bladeren er slap bijhangen. In voor het pathogeen gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur ongeveer 25 ° C, 100 % luchtvochtigheid) volgen na enkele dagen epinastie en eenzijdige of totale verwelking van de plant, waarna deze volledig inzakt. In minder gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur lager dan 21 ° C) treedt minder verwelking op, maar kunnen zich aan de stengel grote aantallen bijwortels ontwikkelen.

Vanaf de voet van de stengel verschijnen met water verzadigde ribbels, wat wijst op necrose in het vaatstelsel. Als de stengel dwars wordt doorgesneden, komt er wit of gelig bacterieslijm uit het bruin verkleurde vaatweefsel 1.3. Symptomen bij andere waardplanten Solanum dulcamara (bitterzoet) en S. nigrum (zwarte nachtschade) - In het wild wordt verwelking bij deze onkruidplanten zelden waargenomen, tenzij bij bodemtemperaturen van meer dan 25 ° C of extreem hoge inoculumniveaus (bijvoorbeeld wanneer S. nigrum vlak naast zieke aardappel- of tomatenplanten groeit). Als verwelking wel optreedt, zijn de symptomen dezelfde als bij tomaat. Niet-verwelkende S. dulcamara die met wortel en stengel in water staat kan op een dwarse doorsnede van de onderste of onder water gelegen stengeldelen een lichtbruine verkleuring van het vaatweefsel vertonen. Bacterieslijm of -slijmdraden kunnen uit het vaatweefsel komen als een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, ook als er geen verwelkingssymptomen zijn. 2. Snelle screeningstests Snelle screeningstests zijn nuttig voor een voorlopige diagnose, maar niet essentieel.Voer een of meer van de onderstaande gevalideerde tests uit. 2.1. Slijmdradentest (Zie VI.A.1) 2.2. Detectie van poly-?-hydroxybutyraatkorrels (PHB-korrels) Kleur thermisch gefixeerde uitstrijkjes bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel op een objectglaasje met nijlblauw A of soedanzwart om de karakteristieke PHB-korrels in de cellen van R. solanacearum te zien (VI.A.2). 2.3. Serumagglutinatietests (Zie VI.A.3) 2.4. Andere tests Andere geschikte snelle screeningstests zijn onder meer de IF-test (VI.A.5), FISH-test (VI.A.7), ELISA-tests (VI.A.8) en PCR-tests (VI.A.6). 3. Isolatieprocedure a) Neem wat slijm of verkleurd vaatweefsel uit de aardappelknol of uit de stengel van de verwelkte aardappel-, tomaten- of andere waardplant. Suspendeer dit in een klein volume steriel gedestilleerd water of steriele fosfaatbuffer 50 mM (aanhangsel 4) en laat 5-10 minuten staan. b) Maak een reeks decimale verdunningen van de suspensie.c) Breng 50-100 µl van de suspensie en verdunningen over op een algemeen medium (NA, YPGA of SPA;aanhangsel 2) en/of op Kelman's tetrazoliummedium (aanhangsel 2) of een ander gevalideerd selectief medium (zoals SMSA; aanhangsel 2). Gebruik daarvoor een geschikte techniek. Plaat als positieve controle eventueel ook een verdunde celsuspensie van R. solanacearum biovar 2 uit. d) Incubeer de platen 2-6 dagen bij 28 ° C. - Op een algemeen medium vormen virulente isolaten van R. solanacearum parelwitte, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies, vaak met kenmerkende slierten in het midden. Avirulente isolaten vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig roomkleurige, botervette kolonies. - Op Kelman's tetrazolium en SMSA zijn de slierten bloedrood.

Avirulente isolaten van R. solanacearum vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig dieprode, botervette kolonies. 4. Identificatietests voor R.solanacearum Onder VI. B worden tests beschreven om de identificatie van vermoedelijke isolaten van R. solanacearum te bevestigen.

DEEL III 1. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen 1.1. Bereiding van de monsters Opmerkingen - De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. Intensievere bemonstering houdt in dat er meer tests op monsters van deze grootte worden genomen. Wanneer een groter aantal knollen per monster wordt genomen, treedt remming op of zijn de resultaten moeilijk te interpreteren. De procedure is echter ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen, wanneer er niet zoveel beschikbaar zijn. - De hierna beschreven detectiemethoden zijn gevalideerd met monsters van 200 knollen. - Het hierna beschreven aardappelextract kan ook worden gebruikt voor de detectie van de aardappelringrotbacterie, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Facultatieve behandeling vóór de bereiding van het monster : a) Incubeer de monsters vooraf maximaal twee weken voor de test bij 25-30 ° C, zodat eventueel aanwezige R.solanacearum zich vermenigvuldigt. b) Was de knollen.Gebruik geschikte ontsmettingsmiddelen (als een PCR-test uitgevoerd wordt, chloorverbindingen om eventueel aanwezig pathogeen-DNA te verwijderen) en reinigingsmiddelen na elk monster.

Laat de knollen aan de lucht drogen. Deze wasprocedure is vooral nuttig, maar niet verplicht, voor monsters met veel aanhangende grond en als een PCR-test of directe isolatie moet worden uitgevoerd. 1.1.1. Verwijder met een schoon, ontsmet scalpel of aardappelschilmes de schil aan het naveleinde (stoloon) van elke knol, zodat het vaatweefsel zichtbaar wordt. Snij voorzichtig een kleine kegelvormige kern vaatweefsel uit het naveleinde van elke knol en zorg er daarbij voor dat deze zo weinig mogelijk niet-vaatweefsel bevat.

NB : Houd (rottende) knollen met verdachte symptomen van bruinrot apart en test die afzonderlijk Als bij het uitsnijden van het naveleindstukje voor bruinrot verdachte symptomen worden waargenomen, moet de knol visueel worden onderzocht en bij de navel worden doorgesneden. Doorgesneden knollen met vermoedelijke symptomen moeten ten minste twee dagen bij kamertemperatuur worden bewaard om verkurking te laten optreden en vervolgens gekoeld (bij 4-10 ° C) onder de juiste quarantaineomstandigheden worden opgeslagen. Alle knollen, ook die met verdachte symptomen, moeten overeenkomstig bijlage III worden bewaard. 1.1.2. Verzamel de naveleindstukjes in ongebruikte afsluitbare of verzegelbare wegwerpcontainers (als de containers wel opnieuw gebruikt worden, moeten ze grondig worden gereinigd en met chloorverbindingen worden ontsmet). De naveleindstukjes worden bij voorkeur direct verwerkt. Is dat niet mogelijk, dan moeten ze zonder toevoeging van buffer in de container worden bewaard; gekoeld mogen ze hooguit 72 uur worden bewaard, bij kamertemperatuur hooguit 24 uur.

Verwerk de naveleindstukjes volgens een van onderstaande procedures : a) overgiet de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud 4 uur (bij minder dan 24° C) of 16-24 uur (gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of b) homogeniseer de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) in een blender (bv.Waring of Ultra Thurax) of door ze fijn te maken in een afgesloten wegwerpbaar maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba sterk polytheen, 150 x 250 mm, met straling gesteriliseerd) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex).

NB : Bij gebruik van een blender is er een groot risico op kruisbesmetting tussen de monsters. Neem maatregelen om aërosolvorming en morsen tijdens de extractie te vermijden. Voor elk monster moeten pas gesteriliseerde blendermessen en vaten gebruikt worden. Als de PCR-test wordt gedaan, moet worden vermeden dat er DNA in de containers of maalapparatuur achterblijft. Aanbevolen wordt om voor de PCR-test het materiaal in wegwerpzakjes fijn te maken en wegwerpbuisjes te gebruiken 1.1.3. Schenk de bovenstaande vloeistof af. Als de vloeistof erg troebel is, kan dit worden verholpen door centrifugeren bij laag toerental (maximaal 180 g, 10 minuten, 4-10 ° C) of vacuümfiltratie (40-100 µm) waarbij het filter met ongeveer 10 ml extractiebuffer wordt nagespoeld. 1.1.4. Concentreer de bacteriefractie door 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g (of 10 minuten bij 10 000 g) bij 4-10 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. 1.1.5. Resuspendeer de pellet in 1,5 ml pelletbuffer (aanhangsel 4).

Gebruik 500 µl voor de test op R. solanacearum, 500 µl voor die op Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en 500 µl voor referentiedoeleinden. Voeg aan het referentiealiquot van 500 µl en aan het niet-gebruikte analysealiquot steriele glycerol toe tot een eindconcentratie van 10-25 % (V/V), vortex en bewaar tussen - 16 en - 24 ° C (enkele weken) of - 68 en - 86 ° C (enkele maanden). Bewaar de analysealiquots tijdens de test bij 4-10 ° C. Herhaald invriezen en ontdooien wordt niet aangeraden.

Als het extract moet worden vervoerd, moet het binnen 24 à 48 uur in een koelbox worden afgeleverd. 1.1.6. Alle positieve R. solanacearum-controles en -monsters moeten gescheiden behandeld worden om contaminatie te voorkomen. Dit geldt voor de IF-glaasjes en voor alle tests. 1.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels : selectieve isolatie (VI.A.4);

IF-test (VI.A.5);

PCR-tests (VI.A.6);

FISH-test (VI.A.7);

ELISA-tests (VI.A.8); bioassay (VI.A.9). 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere waardplanten 2.1. Bereiding van de monsters NB : Voor de detectie van latente R. solanacearum-populaties wordt aangeraden samengestelde monsters te testen. De methode is goed bruikbaar voor samengestelde monsters van maximaal 200 stengeldelen.

Surveyonderzoeken moeten gebaseerd zijn op een statistisch representatieve steekproef van de onderzochte plantenpopulatie. 2.1.1. Doe stengeldelen van 1-2 cm in een gesloten steriele container overeenkomstig de onderstaande bemonsteringsprocedures.

Zaailingen van tomatenplanten : Snij met een schoon, ontsmet mes een stuk van 1 cm van het onderste deel van elke stengel, vlak boven het bodemniveau.

Kas- of vollegrondtomatenplanten : Snij met een schoon, ontsmet mes de onderste zijscheut van elke plant zo dicht mogelijk bij de hoofdstengel af. Neem de onderste 1 cm van elke zijscheut.

Andere planten : Snij met een schoon, ontsmet mes of dito snoeischaar een stuk van 1 cm van het onderste deel van de stengel af, vlak boven het bodemniveau. Snij van S. dulcamara of andere in water groeiende planten een stuk van 1-2 cm van het deel van de stengel onder water of de stoloon met waterwortels.

Test bij het bemonsteren van een bepaalde plaats bij voorkeur een statistisch representatieve steekproef van ten minste tien planten per bemonsteringspunt van elke mogelijke onkruidwaard. Het pathogeen is het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, al kan natuurlijke infectie in overblijvend bitterzoet (S. dulcamara) in waterlopen het hele jaar worden gedetecteerd. Het organisme komt onder meer voor in aardappelopslag, S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium en andere planten van de nachtschadefamilie, en daarnaast in Pelargonium spp. en Portulaca oleracea. R. solanacearum biovar 2/ras 3 kan in specifieke omstandigheden voorkomen in de wortel of rizosfeer van Europese onkruidsoorten als Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfara en Urtica dioica.

NB : In dit stadium kan het visuele onderzoek naar inwendige symptomen (vaatverkleuring of bacterieslijm) plaatsvinden. Bewaar en test stengeldelen met symptomen afzonderlijk (zie deel II). 2.1.2. Ontsmet de stengeldelen kort met ethanol 70 % en dep ze direct droog met tissuepapier. Verwerk de stengeldelen daarna volgens een van de volgende procedures : a) overgiet de stengeldelen met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud gedurende 4 uur (bij minder dan 24 ° C) dan wel 16-24 uur (indien gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of b) verwerk de stengeldelen onmiddellijk door ze fijn te maken in een sterk maceratiezakje (bv.Stomacher of Bioreba) met voldoende extractiebuffer (aanhangsel 4) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). Is dit niet mogelijk, dan kunnen ze gekoeld hooguit 72 uur worden bewaard en bij kamertemperatuur hooguit 24 uur. 2.1.3. Laat 15 minuten bezinken en schenk de bovenstaande vloeistof af. 2.1.4. Het is doorgaans niet nodig het extract verder te zuiveren of de bacteriefractie te concentreren; desgewenst kan dit worden gedaan door filtratie en/of centrifugering zoals beschreven onder III.1.1.3 tot 1.1.5. 2.1.5. Verdeel het oorspronkelijke of geconcentreerde monsterextract in twee gelijke delen. Houd de ene helft gedurende de test op 4-10 ° C en bewaar de andere helft na toevoeging van 10-25 % (V/V) steriele glycerol tussen - 16 en - 24 ° C (enkele weken) of - 68 en - 86 ° C (enkele maanden) voor het geval verder test nodig is. 2.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels : selectieve isolatie (VI.A.4);

IF-test (VI.A.5);

PCR-tests (VI.A.6);

FISH-test (VI.A.7);

ELISA-tests (VI.A.8); bioassay (VI.A.9).

DEEL IV 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in water

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in water Principe Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in oppervlaktewatermonsters en monsters van afvalwater van aardappelverwerkingsinstallaties of riooleffluent. De verwachte detectiegevoeligheid hangt echter af van het substraat. De gevoeligheid van de isolatietest hangt af van de populatie concurrerende saprofytische bacteriën, die doorgaans veel groter is in aardappelverwerkingsafvalwater of effluent dan in oppervlaktewater.

Met de onderstaande methode kan in oppervlaktewater een concentratie van 103 cellen per liter nog worden gedetecteerd, maar voor afvalwater ligt de gevoeligheid waarschijnlijk aanzienlijk lager. Daarom wordt afvalwater het beste getest na een eventuele zuivering (bv. sedimentatie, filtratie), waardoor de populatie saprofytische bacteriën wordt gereduceerd. Bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen moet rekening worden gehouden met de gevoeligheid van de testmethode. Deze methode is met succes toegepast bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in oppervlaktewater, maar heeft haar beperkingen bij vergelijkbaar onderzoek op aardappelverwerkingsafvalwater of riooleffluent. 2.1. Bereiding van de monsters Opmerkingen - In oppervlaktewater is R. solanacearum het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, bij een watertemperatuur van meer dan 15 ° C. - Herhaalde bemonstering van dezelfde plaatsen op verschillende tijdstippen in die periode reduceert de weersinvloed en verhoogt daardoor de betrouwbaarheid van de detectie. - Zware regenval en de geografie van de waterloop kunnen leiden tot een grote verdunning die de aanwezigheid van het pathogeen kan maskeren. - Bemonster oppervlaktewater in de buurt van waardplanten (indien aanwezig). 2.1.1. Neem op de bemonsteringsplaatsen in steriele wegwerpbuizen of -flessen watermonsters op een diepte van meer dan 30 cm (indien mogelijk) en binnen 2 m van de oever. Neem afvalwater- of effluentmonsters bij het lozingspunt. Neem bij voorkeur monsters van maximaal 500 ml per bemonsteringspunt. Als kleinere monsters worden genomen, worden op elke bemonsteringsplaats bij voorkeur op ten minste drie verschillende tijdstippen telkens twee submonsters in duplo van ten minste 30 ml genomen. Kies voor intensief onderzoek ten minste drie bemonsteringsplaatsen per 3 km waterloop en bemonster ook de zijwaterlopen. 2.1.2. Vervoer de monsters koel (4-10 ° C) en in het donker en test ze binnen 24 uur. 2.1.3. Concentreer de bacteriefractie indien nodig op een van de volgende manieren : a) centrifugeer submonsters van 30-50 ml 10 minuten bij 10 000 g (of 15 minuten bij 7 000 g), bij voorkeur bij 4-10 ° C.Giet de bovenstaande vloeistof af. Resuspendeer de pellet in 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4); b) filtreer de suspensie door een membraan (minimale maasgrootte 0,45 µm).Was het filter met 5-10 ml pelletbuffer en bewaar de wasvloeistof. Deze werkwijze is geschikt voor grotere volumes water met weinig saprofyten.

Monsters van aardappelverwerkingsafvalwater of effluent worden doorgaans beter niet geconcentreerd, omdat te grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën de detectie van R. solanacearum hinderen. 2.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels.

DEEL V 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in grond

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in grond Principe Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in bodemmonsters en monsters van vast aardappelverwerkingsafval of rioolslib. Ze is echter niet gevoelig genoeg om detectie van lage concentraties of onregelmatig verspreide populaties van R. solanacearum in natuurlijk besmette monsters van deze substraten te waarborgen.

Houd bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen en bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in bodems of slib rekening met de gevoeligheid van de testmethode. De betrouwbaarste manier om na te gaan of het pathogeen in een bodem aanwezig is, is een vatbare waardplant te planten en op infectie te controleren, maar ook met die methode kunnen lage besmettingsniveaus niet altijd worden gedetecteerd. 2.1. Bereiding van de monsters 2.1.1. Neem bodemmonsters volgens de standaardprincipes voor bemonstering bij nematodenonderzoek. Verzamel 0,5- 1 kg grond per monster op 60 plaatsen per 0,3 ha (in een raster van 7 x 7 m) op een diepte van 10-20 cm. Gebruik 120 bemonsteringspunten per 0,3 ha als aanwezigheid van het pathogeen wordt vermoed. Bewaar de monsters bij 12-15 ° C. Bemonster aardappelverwerkings- en rioolslib door in totaal 1 kg slib te verzamelen dat representatief is voor het hele te testen volume. Meng elk monster grondig voor het testen. 2.1.2. Dispergeer submonsters van 10-25 g grond of slib in 60-150 ml extractiebuffer (aanhangsel 4) op een rondschudapparaat (250 rpm, maximaal 2 uur). Voeg zo nodig steriele 0,02 % Tween 20 en 10-20 g steriele kiezel toe voor een betere dispersie. 2.1.3. Bewaar de suspensie tijdens het testen bij 4 ° C. 2.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels.

DEEL VI. - Geoptimaliseerde protocollen voor de detectie en identificatie van R. solanacearum A. Diagnose en detectie 1. Slijmdradentest De volgende eenvoudige oriënterende test geeft aan of R.solanacearum aanwezig is in stengels van verwelkende aardappel-, tomaten- of andere planten. Snij de stengel vlak boven het bodemniveau af. Dompel het snijvlak in een buis schoon water. Kijk of er na enkele minuten spontaan bacterieslijmdraden uit de doorgesneden vaatbundels komen. 2. Detectie van poly-?-hydroxybutyraatkorrels 1.Maak op een objectglaasje een uitstrijkje van bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel of uit een 48 uur oude kweek op YPGA- of SPA-medium (aanhangsel 2). 2. Maak uitstrijkjes van een biovar 2-stam van R.solanacearum als positieve controle en eventueel van een bekende PHB-negatieve soort als negatieve controle. 3. Laat aan de lucht drogen en haal elk glaasje door de vlam om de uitstrijkjes te fixeren.4. Kleur de preparaten met nijlblauw of soedanzwart en bekijk ze onder de microscoop volgens de onderstaande procedure. Nijlblauwkleuring a) Overgiet elk glaasje met een 1 % oplossing van nijlblauw A in water.Incubeer 10 minuten bij 55 ° C. b) Laat de kleuroplossing weglopen.Spoel even in rustig stromend kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier. c) Overgiet met azijnzuur 8 % en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur.d) Spoel even in rustig stromend kraanwater.Verwijder overtollig water met tissuepapier. e) Herbevochtig met een druppel water en breng een dekglaasje aan.f) Bekijk het preparaat met een epifluorescentiemicroscoop (450 nm, olie-immersie, 600-1 000 x).g) Kijk of er een helderoranje fluorescentie van PHB-korrels te zien is.Controleer onder doorvallend natuurlijk licht of de korrels zich wel degelijk in de cellen bevinden en de celmorfologie karakteristiek is voor R.solanacearum.

Soedanzwartkleuring a) Overgiet elk glaasje met een 0,3 % oplossing van sudanzwart B in ethanol 70 %.Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. b) Laat de kleuroplossing weglopen.Spoel even met kraanwater.

Verwijder overtollig water met tissuepapier. c) Dompel even in xyleen en dep droog op tissuepapier.Let op! Xyleen is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast. d) Overgiet met waterige safranineoplossing 0,5 % (m/V) en laat 10 seconden bij kamertemperatuur inwerken.Let op! Safranine is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast. e) Spoel in rustig stromend kraanwater.Dep droog op tissuepapier.

Breng een dekglaasje aan. f) Bekijk het preparaat met een lichtmicroscoop onder doorvallend licht (olie-immersie, 1 000 x).g) Kijk of er blauwzwarte PHB-korrels te zien zijn in R. solanacearum-cellen met roze celwanden. 3. Serumagglutinatietests Agglutinatie van R.solanacearum-cellen in bacterieslijm of weefselextract van planten met symptomen is het beste waar te nemen met gevalideerde antilichamen (aanhangsel 3) die met kleur zijn gelabeld, bv. met rode Staphylococcus aureus of gekleurde latexdeeltjes. Volg bij gebruik van in de handel verkrijgbare kits (aanhangsel 3) de instructies van de fabrikant en anders de volgende procedure : a) Meng ongeveer 5 µl van een suspensie van gelabeld antilichaam met ongeveer 5 µl bacterieslijm op venstertjes van een objectglaasje met meerdere venstertjes.b) Maak positieve en negatieve controles met suspensies van R. solanacearum biovar 2 en een heterologe stam. c) Meng zachtjes gedurende 15 seconden.In positieve monsters treedt agglutinatie op. 4. Selectieve isolatie 4.1. Selectieve uitplating NB : Controleer vóór de eerste toepassing van deze methode of de toevoeging van 103-104 kve/ml R. solanacearum aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar wordt gedetecteerd.

Gebruik een geschikt gevalideerd selectief medium, bv. SMSA zoals gemodificeerd door Elphinstone e.a. (1996) (aanhangsel 2).

Om R. solanacearum te onderscheiden van andere bacteriën die op het medium kolonies kunnen vormen, is zorg vereist. Kolonies van R. solanacearum kunnen bovendien een atypische morfologie vertonen op overvolle platen en in aanwezigheid van antagonistische bacteriën.

Test het monster bij een vermoeden van concurrentie of antagonisme met een andere test opnieuw.

Deze methode is het gevoeligst met vers bereide monsterextracten. Zij kan echter ook worden gebruikt met extracten die tussen - 68 en - 86 ° C in glycerol zijn bewaard.

Maak als positieve controle decimale verdunningen van een suspensie van 106 kve/ml van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Om contaminatie uit te sluiten moeten de positieve controles volledig gescheiden van de analysemonsters worden bereid Ga voor elke nieuw bereide charge van een selectief medium na of die geschikt is voor het kweken van de bacterie en gebruik haar pas daarna om routinemonsters te testen.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters. 4.1.1. Neutraliseer eventueel aanwezige saprofytische kolonievormende populaties door verdunning en uitplating. Strijk per plaat monsterextract en per verdunning 50-100 µl uit. 4.1.2. Incubeer de platen bij 28 ° C. Bekijk ze na 48 uur en daarna zes dagen lang dagelijks. Karakteristieke kolonies van R. solanacearum op SMSA zijn melkwit, plat, onregelmatig en uitvloeiend; na drie dagen incubatie worden ze in het midden roze tot bloedrood, met interne strepen en slierten.

NB : R. solanacearum vormt op dit medium soms ook atypische kolonies.

Deze kunnen klein, rond, helemaal rood en niet of slechts gedeeltelijk uitvloeiend zijn, waardoor ze moeilijk van saprofytische kolonievormende bacteriën te onderscheiden zijn. 4.1.3. Kweek vermoedelijke R. solanacearum-kolonies rein na uitstrijken of uitplaten van verdunningen op een algemeen medium om geïsoleerde kolonies te krijgen (aanhangsel 2). 4.1.4. De kweek kan worden bewaard in steriel water (pH 6-8, chloorvrij) in het donker en bij kamertemperatuur (kort) of in een geschikt cryoprotectans bij - 68 à - 86 ° C of gevriesdroogd (lang). 4.1.5. Identificeer vermoedelijke culturen (VI. B) en voer een pathogeniteitstest uit (VI. C).

Interpretatie van het resultaat van de selectieve uitplating De test is negatief als de platen na zes dagen geen kolonies of geen vermoedelijke R. solanacearum-kolonies vertonen, mits er geen aanwijzingen zijn voor remming door concurrentie of antagonisme van andere bacteriën en de positieve controles wel karakteristieke R. solanacearum-kolonies vertonen.

De test is positief als er vermoedelijke R. solanacearum-kolonies worden geïsoleerd. 4.2. Ophopingsprocedure Gebruik een gevalideerd ophopingsmedium, bv. gemodificeerde Wilbrink-bouillon (aanhangsel 2).

Deze procedure dient om populaties van R. solanacearum in monsterextracten selectief te stimuleren en de detectiegevoeligheid te verbeteren. Ook worden remmers van de PCR-reactie doeltreffend verdund (1 :100). De ophoping van R. solanacearum kan echter mislukken door concurrentie of antagonisme van saprofytische organismen die vaak ook worden gestimuleerd. Daarom is isolatie van R. solanacearum uit kweken in ophopingsbouillon soms moeilijk. Voor de ELISA-test verdienen specifieke monoklonale (in plaats van polyklonale) antilichamen de voorkeur, daar populaties van serologisch verwante saprofyten ook kunnen toenemen. 4.2.1. Breng voor ophoping+PCR 100 µl monsterextract over in 10 ml ophopingsbouillon (aanhangsel 2) in DNA-vrije buisjes of flesjes. Voor ophoping+ELISA kan de concentratie van het monsterextract worden verhoogd (bv. 100 µl in 1,0 ml ophopingsbouillon). 4.2.2. Incubeer 72 uur bij 27-30 ° C (al dan niet op een schudapparaat) met de dop los op de buisjes voor de beluchting. 4.2.3. Meng de suspensies voor de ELISA- of PCR-test grondig. 4.2.4. Behandel de bouillon vervolgens op dezelfde manier als de monsters in de boven beschreven tests.

NB : Bij een hoge kans op remming van de ophoping van R. solanacearum door grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën levert ophoping van de monsterextracten vóór centrifugering of andere concentratiestappen vaak betere resultaten op. 5. Immunofluorescentiestest (IF-test) Principe De IF-test wordt als eerste screeningstest aanbevolen vanwege de aangetoonde robuustheid ten opzichte van de vereiste drempelwaarden. Wanneer de IF-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede screeningstest een isolatie-, PCR- of FISH-test worden gedaan. Wanneer de IF-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd voor de verdere analyses.

NB : Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum.

Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugaat, overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. De gevalideerde polyklonale antiserums hebben allemaal een IF-titer van ten minste 1:2 000. Bij de test moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer.

De test moet worden uitgevoerd op vers bereide monsterextracten. Zo nodig kan de test ook goed worden uitgevoerd op extracten die tussen - 68 en - 86 ° C in glycerol zijn bewaard. De glycerol kan uit het monster worden verwijderd door toevoegen van 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4), 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g en resuspensie in een gelijk volume pelletbuffer. Dit is vaak niet nodig, met name als de monsters op de objectglaasjes worden gefixeerd door ze door de vlam te halen.

Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B), en eventueel in buffervloeistof.

Natuurlijk geïnfecteerd weefsel (geconserveerd door vriesdrogen of invriezen bij -16 tot - 24 ° C) moet zo mogelijk als soortgelijke controle op hetzelfde glaasje worden gebruikt.

Als negatieve controle kunnen aliquots monsterextract worden gebruikt waarbij een eerdere test voor R. solanacearum negatief was.

Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Gebruik microscoopglaasjes met meerdere venstertjes, bij voorkeur tien venstertjes met een diameter van minstens 6 mm.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters. 5.1. Prepareer de objectglaasjes volgens een van onderstaande procedures : i) voor pellets met betrekkelijk weinig zetmeelsediment : Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm - vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van een 1:100-verdunning van de geresuspendeerde aardappelpellet op het eerste venstertje.Pipetteer vervolgens eenzelfde volume onverdunde pellet (1/1) op de resterende venstertjes van de rij. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 1. ii) voor andere pellets : Maak decimale oplossingen (1:10 en 1:100) van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm - vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van de geresuspendeerde pellet en van elke verdunning op een rij venstertjes. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 2. 5.2. Laat de druppels bij kamertemperatuur of door verwarming tot 40-45 ° C drogen. Fixeer de bacteriecellen op het glaasje door het te verwarmen (15 minuten op 60 ° C), door het door de vlam te halen, met ethanol 95 % of volgens de specifieke aanwijzingen van de leverancier van de antilichamen.

Zo nodig kunnen de gefixeerde glaasjes hierna bevroren in een doos met droogmiddel bewaard worden voor verder test (dit mag niet langer dan nodig en hooguit drie maanden duren). 5.3 . IF-procedure i) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 5.1. i) : Maak een reeks tweevoudige verdunningen. Het eerste venstertje krijgt een halve titer (T/2) en de volgende een kwart titer (T/4), een halve titer (T/2), een titer (T) en twee titers (2T). ii) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 5.1. ii) : Maak de werkverdunning van het antilichaam aan in IF-buffer. De werkverdunning beïnvloedt de specificiteit.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 5.3.1. Leg de glaasjes op vochtig tissuepapier. Bedek alle testvenstertjes volledig met antilichaamverdunning. Het op elk venstertje aangebrachte volume antilichaam moet ten minste gelijk zijn aan het volume aangebracht extract.

Wanneer de leverancier van de antilichamen geen specifieke aanwijzingen heeft verstrekt, moet de volgende procedure worden gevolgd. 5.3.2. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C). 5.3.3. Schud de druppels van elk glaasje af en spoel de glaasjes zorgvuldig met IF-buffer. Was door onderdompeling gedurende 5 minuten in IF-buffer-Tween (aanhangsel 4) en vervolgens in IF-buffer. Vermijd aërosolvorming en druppeloverdracht waardoor kruisbesmetting kan optreden. Verwijder overtollig vocht zorgvuldig door zachtjes af te deppen. 5.3.4. Leg de glaasjes op vochtig papier. Bedek alle venstertjes met de verdunning van het FITC-conjugaat die gebruikt werd om de titer te bepalen. Het volume conjugaat op de venstertjes moet identiek zijn aan het volume antilichaam. 5.3.5. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C). 5.3.6. Schud de druppels conjugaat van het glaasje af. Spoel af en was als voorheen (5.3.3).

Verwijder overtollig vocht zorgvuldig. 5.3.7. Pipetteer 5-10 l 0,1 M fosfaatgebufferde glycerol (aanhangsel 4), of een in de handel verkrijgbaar antifading inbedmiddel, op elk venstertje en breng een dekglaasje aan. 5.4. Aflezen van de IF-test 5.4.1 Bekijk de glaasjes met een epifluorescentiemicroscoop die voorzien is van geschikte filters voor excitatie van FITC (olie- of waterimmersie, 500-1 000 x). Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden.

Onderzoek eerst het positieve controleglaasje. De cellen moeten helder fluorescerend en volledig gekleurd zijn bij de bepaalde antilichaamtiter of werkverdunning. De IF-test (VI.A.5) moet herhaald worden bij afwijkende kleuring. 5.4.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende morfologie. De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan die van de positieve controlestam bij dezelfde antilichaamverdunning. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden.

Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes. 5.4.3. Aan de immunofluorescentietest zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden vaak achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën gevonden die qua grootte en morfologie lijken op R. solanacearum. 5.4.4. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie bij de titer of werkverdunning van de antilichamen zoals aangegeven in punt 5.3. 5.4.5. Interpretatie van de IF-test i) Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 5). De IF-uitslag is positief als het monster ten minste 5 x 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat. Het monster wordt als mogelijk besmet aangemerkt en moet nader onderzocht worden. ii) De IF-test is negatief als het monster minder dan 5 x 103 cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat; het monster wordt als negatief aangemerkt. Verder test is dan niet nodig. 6. Polymerasekettingreactietest (PCR-test) Principe Wanneer de PCR-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningstest isolatie of IF worden gedaan.Wanneer PCR als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

Het wordt aangeraden deze methode alleen algemeen als eerste screeningstest te gebruiken als er voldoende gespecialiseerde ervaring mee is opgedaan.

NB : Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten 103-104 cellen/ml R. solanacearum, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden.

Er kunnen optimalisatieproeven nodig zijn om in alle laboratoria een maximale gevoeligheid en specificiteit te bereiken.

Gebruik gevalideerde PCR-reagentia en -protocollen (aanhangsel 6).

Kies bij voorkeur een methode met een interne controle.

Neem de nodige voorzorgen om contaminatie van het monster met doel-DNA te vermijden. De PCR-test moet worden uitgevoerd door ervaren analisten in speciale moleculair-biologische laboratoria om de kans op contaminatie met doel-DNA tot een minimum te beperken.

Negatieve controles (bij de DNA-extractie en de PCR-procedures) moeten altijd op dezelfde wijze worden behandeld als de uiteindelijke monsters, om na te gaan of er verontreiniging met DNA is opgetreden.

In de PCR-test moeten de volgende negatieve controles worden meegenomen : - monsterextract waarbij een eerdere test op R. solanacearum negatief was; - controles met de buffer die bij de extractie van de bacterie en het DNA uit het monster is gebruikt; - PCR-reactiemix.

Als positieve controles moeten worden genomen : - aliquots van geresuspendeerde pellets waaraan R. solanacearum is toegevoegd (voor de bereiding zie aanhangsel 3, onder B); - een suspensie van 106 cellen/ml van R. solanacearum in water uit een virulent isolaat (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3, onder B); - gebruik zo mogelijk ook DNA dat is geëxtraheerd uit positieve controlemonsters in de PCR-test.

Om contaminatie te vermijden moeten de positieve controles in een andere ruimte worden bereid dan de analysemonsters.

De monsterextracten moeten zoveel mogelijk vrij van grond zijn. Het kan dus soms raadzaam zijn om extracten uit gewassen aardappelen te bereiden als er PCR-protocollen gebruikt zullen worden.

Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test. 6.1. DNA-zuiveringsmethoden Gebruik positieve en negatieve controlemonsters zoals hierboven beschreven (aanhangsel 3).

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

Er zijn diverse methoden beschikbaar voor het zuiveren van doel-DNA uit complexe monstersubstraten, waarbij remmers van de PCR en andere enzymatische reacties worden verwijderd en het doel-DNA in het monsterextract wordt geconcentreerd. De volgende methode is geoptimaliseerd voor gebruik met de gevalideerde PCR-methoden als beschreven in aanhangsel 6. a) Methode volgens Pastrik (2000) 1) Pipetteer 220 µl lysisbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in een eppendorfbuisje van 1,5 ml.2) Voeg 100 µl monsterextract toe en zet het buisje 10 minuten in een verwarmingsblok of waterbad op 95 ° C.3) Koel het buisje 5 minuten op ijs.4) Voeg 80 µl lysozym-voorraadoplossing (50 mg lysozym per ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toe en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.5) Voeg 220 µl Easy DNAR solution A (Invitrogen) toe, vortex grondig en incubeer 30 minuten bij 65 ° C.6) Voeg 100 µl Easy DNAR solution B (Invitrogen) toe, vortex krachtig tot het neerslag vrij in het buisje beweegt en het monster gelijkmatig viskeus is.7) Voeg 500 µl chloroform toe en vortex tot de viscositeit afneemt en het mengsel homogeen is.8) Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 ° C om de fasen te scheiden en de interfase te vormen.9) Breng de bovenste fase over in een schoon eppendorfbuisje.10) Voeg 1 ml ethanol 100 % (- 20 ° C) toe, vortex kort en incubeer 10 minuten op ijs.11) Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 ° C en verwijder de ethanol van de pellet.12) Voeg 500 µl ethanol 80 % (- 20 ° C) en meng door het buisje om te keren.13) Centrifugeer 10 minuten bij 15 000 g en 4 ° C, bewaar de pellet en verwijder de ethanol.14) Droog de pellet aan de lucht of in een DNA Speed Vac 15) Resuspendeer de pellet in 100 µl steriel UPW en laat minstens 20 minuten bij kamertemperatuur staan.16) Bewaar bij - 20 ° C voor de PCR.17) Draai eventueel aanwezig wit neerslag af in een centrifuge en gebruik 5 µl van de bovenstaande vloeistof, die het DNA bevat, voor de PCR.b) Andere methoden Er kunnen andere DNA-extractiemethoden (bv.Qiagen DNeasy Plant Kit) worden gebruikt, mits die even doeltreffend blijken te zijn bij het zuiveren van DNA uit controlemonsters met 103-104 pathogene cellen/ml. 6.2. PCR 6.2.1. Bereid analyse- en controletemplates voor de PCR volgens de gevalideerde protocollen (VI.A.6). Bereid een tienvoudige verdunning van monster-DNA-extract (1:10 in UPW). 6.2.2. Bereid de geschikte PCR-reactiemix in een contaminatievrije omgeving volgens de gepubliceerde protocollen (aanhangsel 6). Gebruik zo mogelijk een multiplex-PCR-protocol met interne PCR-controle 6.2.3. Voeg volgens de PCR-protocollen in steriele PCR-buisjes 2-5 µl DNA-extract toe per 25 µl PCR-reactiemix (aanhangsel 6). 6.2.4. Neem ook een negatief controlemonster mee met alleen PCR-reactiemix; voeg hieraan in plaats van het monster UPW toe uit dezelfde bron als in de PCR-mix is gebruikt. 6.2.5. Zet de buisjes in hetzelfde PCR-apparaat als voor de voorbereidende tests is gebruikt en werk het geoptimaliseerde PCR-programma af (aanhangsel 6). 6.3. Analyse van het PCR-product 6.3.1. Scheid de amplicons met behulp van agarosegelelektroforese.

Laat minimaal 12 µl geamplificeerd DNA-reactiemengsel van elk monster, gemengd met 3 µl laadbuffer (aanhangsel 6), lopen in 2,0 % (m/V) agarosegels in TAE-buffer (Tris-acetaat-EDTA, aanhangsel 6) bij 5-8 V/cm. Gebruik een geschikte DNA-marker, bv. 100 bp ladder. 6.3.2. Maak de DNA-banden zichtbaar door kleuring met ethidiumbromide (0,5 mg/l) gedurende 30-60 minuten. Deze stof is mutageen - neem de nodige voorzorgen in acht. 6.3.3. Onderzoek de gekleurde gel door transilluminatie met kortgolvig UV (ë = 302 nm) op geamplificeerde PCRproducten van de verwachte lengte (aanhangsel 6) en leg het resultaat vast. 6.3.4. Ga bij alle nieuwe bevindingen/gevallen na of het PCR-amplicon authentiek is met behulp van een restrictieenzymanalyse op een monster van het resterende geamplificeerde DNA door dat bij de optimale temperatuur en gedurende de optimale tijd met een geschikt enzym en geschikte buffer (aanhangsel 6) te incuberen. Scheid de verkregen fragmenten met behulp van agarosegelelektroforese zoals hierboven beschreven; bekijk het karakteristieke restrictiefragmentpatroon onder UV-transilluminatie na kleuring met ethidiumbromide en vergelijk dit met de niet-gedigesteerde en de gedigesteerde positieve controle.

Interpretatie van het resultaat van de PCR-test De PCR-test is negatief als er geen R. solanacearum-specifiek PCR-amplicon van de verwachte lengte wordt aangetroffen in het analysemonster, maar wel in alle positieve controlemonsters (bij multiplex-PCR met plantspecifieke interne controleprimers moet er een tweede PCR-product van de verwachte lengte met het analysemonster geamplificeerd zijn).

De PCR-test is positief als het R. solanacearum-specifieke PCR-amplicon van de verwachte lengte en met het verwachte restrictiepatroon (indien nodig) wordt aangetoond, mits dit niet in een van de negatieve controlemonsters geamplificeerd is. Een positief resultaat kan ook op betrouwbare wijze worden bevestigd door de test met een tweede set PCR-primers te herhalen (aanhangsel 6).

NB : Als het verwachte amplicon wel bij het positieve controlemonster met R. solanacearum in water wordt verkregen, maar niet bij de positieve controles met R. solanacearum in aardappelextract, is remming van de PCR waarschijnlijk de oorzaak. Bij multiplex-PCR-protocollen met interne PCR-controles is er waarschijnlijk sprake van remming als geen van beide amplicons worden verkregen.

Er moet aan contaminatie worden gedacht als het verwachte amplicon in een of meer van de negatieve controles wordt gevonden. 7. Fluorescentie-in-situ-hybridisatietest (FISH-test) Principe Wanneer de FISH-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningstest een isolatie- of IF-test worden gedaan.Wanneer de FISH-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

NB : Gebruik gevalideerde, R. solanacearum-specifieke oligo-probes (aanhangsel 7). Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten minstens 103-104 cellen van R. solanacearum per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden.

De onderstaande procedure wordt bij voorkeur uitgevoerd op vers bereid monsterextract maar kan ook goed worden uitgevoerd op monsterextract dat in glycerol bewaard is tussen - 16 en - 24 ° C of - 68 en - 86 ° C. Als negatieve controle worden aliquots monsterextract gebruikt waarbij eerdere tests op R. solanacearum negatief waren.

Als positieve controle worden suspensies bereid met 105-106 cellen/ml R. solanacearum biovar 2 (bv. Stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3) in 0,01 M fosfaatbuffer (PB) van een drie- tot vijfdaagse cultuur. Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B).

Het gebruik van de FITC-gelabelde eubacteriële oligo-probe kan als controle voor het hybridisatieproces dienen, omdat hierdoor alle eubacteriën in het monster gekleurd worden.

Zie aanhangsel 3, onder A, voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters. 7.1. Fixatie van het aardappelextract Het volgende protocol is gebaseerd op Wullings e.a. (1998) : 7.1.1. Bereid het fixatief (aanhangsel 7). 7.1.2. Pipetteer 100 µl van elk monsterextract in een eppendorfbuisje en centrifugeer 7 minuten bij 7 000 g. 7.1.3. Verwijder de bovenstaande vloeistof en los de pellet op in 200 µl korter dan 24 uur tevoren bereid fixatief. Vortex en incubeer 1 uur in de koelkast. 7.1.4. Centrifugeer 7 minuten bij 7 000 g, schenk de bovenstaande vloeistof af en resuspendeer de pellet in 75 µl 0,01 M PB (aanhangsel 7). 7.1.5. Breng 16 ~l van de gefixeerde suspensies op een schoon objectglaasje met venstertjes zoals aangegeven in figuur 7.1. Breng twee verschillende monsters op het glaasje, onverdund en in een 1:100-verdunning (gebruik hiervoor 10 µl in 0,01 M PB). De resterende monsteroplossing (49 µl) kan na toevoeging van eenzelfde volume ethanol 96 % bij - 20 ° C worden bewaard. Als de FISH-test herhaald moet worden, wordt de ethanol door centrifugeren verwijderd en een gelijk deel 0,01 M PB toegevoegd en door vortexen gemengd.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 7.1.6. Droog de glaasjes aan de lucht (of op een droger bij 37 ° C) en fixeer ze door ze door de vlam te halen.

Op dit punt kan de procedure worden onderbroken om de volgende dag verder te gaan met de hybridisatie. De objectglaasjes moeten stofvrij en droog bij kamertemperatuur worden bewaard. 7.2. Hybridisatie 7.2.1. Dehydrateer de cellen in een ethanolreeks (50 %, 80 %, 96 %, telkens 1 minuut). Droog de glaasjes aan de lucht in een houder. 7.2.2. Maak een vochtige incubatiekamer door de bodem van een luchtdicht vat te bedekken met tissue- of filtreerpapier, doordrenkt met 1x hybmix (aanhangsel 7). Pre-incubeer het vat in de hybridisatieoven gedurende ten minste 10 minuten bij 45 ° C. 7.2.3. Breng 10 µl hybridisatieoplossing (aanhangsel 7) aan op acht venstertjes (1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 en 10; figuur 7.1) van elk glaasje en laat de twee middelste venstertjes (3 en 8) blanco. 7.2.4. Leg zonder lucht in te sluiten een dekglaasje (24 x 24 mm) op de eerste en laatste vier venstertjes. Zet de objectglaasjes in de voorverwarmde incubatiekamer en hybridiseer 5 uur in de oven in het donker bij 45 ° C. 7.2.5. Bereid drie bekerglazen met 1 l Milli Q (water van moleculair-biologische kwaliteit), 1 l 1X hybmix (334 ml 3x hybmix en 666 ml Milli Q) en 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix en 958 ml Milli Q). Pre-incubeer elk bekerglas in een waterbad bij 45 ° C. 7.2.6. Verwijder de dekglaasjes van de objectglaasjes en doe de objectglaasjes in een houder. 7.2.7. Verwijder de overmaat probe door 15 minuten bij 45 ° C te incuberen in het bekerglas met 1X hybmix. 7.2.8. Zet de houder in de 1/8X hybmix (wasoplossing) en incubeer nogmaals 15 minuten. 7.2.9. Dompel de objectglaasjes even in Milli Q en leg ze op filtreerpapier. Verwijder overtollige vloeistof door het oppervlak voorzichtig met filtreerpapier te bedekken. Pipetteer 5-10 ~l antifading inbedmiddel (bv. Vectashield van Vecta Laboratories, CA, USA of gelijkwaardig) op elk venstertje en leg een groot dekglaasje (24 x 60 mm) op het objectglaasje. 7.3. Aflezen van de FISH-test 7.3.1. Bekijk de objectglaasjes onmiddellijk met een microscoop die geschikt is voor epifluorescentiemicroscopie bij een vergroting van 630 of 1 000 x en olie-immersie. Met een filter dat geschikt is voor fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) lichten eubacteriële cellen (waaronder de meeste gramnegatieve cellen) in het monster groen op.

Met een filter voor tetramethylrodamine-5-isothiocyanaat lichten Cy3-gekleurde cellen van R. solanacearum rood op. Vergelijk de celmorfologie met die van de positieve controles. De cellen moeten helder fluoresceren en volledig gekleurd zijn. Bij afwijkende kleuring moet de FISH-test herhaald worden (VI.A.7). Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden. 7.3.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende morfologie. De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan, of beter dan, die van de positieve controlestam. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden. 7.3.3. Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden.

Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes. 7.3.4. Aan de FISH-test zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden soms, maar veel minder vaak dan bij de IF-test, achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën waargenomen die qua grootte en morfologie lijken op R. solanacearum. 7.3.5. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie. 7.3.6. Interpretatie van het resultaat van de FISH-test i) De resultaten van de FISH-test zijn valide als in alle positieve controles en in geen van de negatieve controles met het FITC-filter heldergroen fluorescerende cellen met een voor R.solanacearum karakteristieke grootte en morfologie worden waargenomen en met het rodaminefilter helderrood fluorescerende cellen. Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 4). Monsters met ten minste 5 x 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als mogelijk besmet aangemerkt. Er is dan verder test nodig. Monsters met minder dan 5 x 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als negatief aangemerkt. ii) De FISH-test is negatief als met het rodaminefilter geen helderrood fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende grootte en morfologie worden waargenomen, mits die met dat filter wel in de positieve controlepreparaten zijn waargenomen. 8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-tests Principe ELISA mag wegens de relatief lage gevoeligheid alleen als facultatieve test naast IF, PCR of FISH worden gebruikt.Bij de DAS-ELISA-test zijn ophoping en monoklonale antilichamen verplicht. Voorafgaande ophoping van de monsters kan de gevoeligheid van ELISA verhogen, maar dit mislukt soms wegens concurrentie van andere organismen in het monster.

NB : Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum.

Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt conjugaat met het tweede antilichaam overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. Bij de test moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer van de commerciële formulering Bepaal de titer van de antilichamen op een suspensie van 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum.

Gebruik als negatieve controle een monsterextract waarbij eerdere tests op R. solanacearum negatief waren en een suspensie van een niet-kruisreagerende bacterie in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

Gebruik als positieve controle aliquots monsterextract waarbij eerdere tests negatief waren, gemengd met 103-104 cellen/ml van R. solanacearum biovar 2 (bv. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3, onder A en B). Gebruik een standaardsuspensie van 105-106 cellen/ml van R. solanacearum in PBS om de resultaten op elke plaat te vergelijken.

Zie aanhangsel 3, onder A, voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

Er zijn twee gevalideerde ELISA-protocollen. a) Indirecte ELISA (Robinson-Smith e.a. (1995)) 1) Gebruik aliquots van 100-200 µl monsterextract.(Soms worden niet-specifieke resultaten gereduceerd door 4 minuten verwarming bij 100 ° C in een waterbad of verwarmingsblok.) 2) Voeg een gelijk volume coatingbuffer van dubbele sterkte toe (aanhangsel 4) en vortex.3) Doe telkens 100 µl in ten minste twee putjes van een microtiterplaat (bv.Nunc-Polysorp of gelijkwaardig) en incubeer 1 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. 4) Schud het extract uit de putjes.Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4) en laat de laatste spoelvloeistof minstens 5 minuten in de putjes. 5) Bereid de benodigde verdunning van antilichamen tegen R. solanacearum in blokkeerbuffer (aanhangsel 4). Gebruik de aanbevolen verdunningen voor gevalideerde in de handel verkrijgbare antilichamen (doorgaans tweemaal de titerconcentratie). 6) Doe 100 µl in elk putje en incubeer 1 uur bij 37 ° C.7) Schud de antilichaamoplossing uit de putjes en spoel zoals onder 4.8) Bereid in blokkeerbuffer de benodigde verdunning conjugaat (tweede antilichaam met alkalische fosfatase).Doe 100 µl in elk putje en incubeer 1 uur bij 37 ° C. 9) Schud het conjugaat uit de putjes en spoel als onder 4.10) Doe 100 µl oplossing van alkalischefosfatasesubstraat (aanhangsel 4) in elk putje.Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en lees gedurende 90 minuten periodiek de extinctie bij 405 nm af. b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA 1) Bereid de benodigde verdunning van polyklonale immunoglobulines tegen R.solanacearum in coatingbuffer (pH 9,6) (aanhangsel 4). Doe 200 µl in elk putje. Incubeer 4-5 uur bij 37 ° C of 16 uur bij 4 ° C. 2) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4). Doe in ten minste twee putjes 190 ~l monsterextract. Doe in telkens twee putjes per plaat ook een positieve en een negatieve controle.

Incubeer 16 uur bij 4 ° C. 3) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).4) Bereid een geschikte verdunning van specifieke monoklonale antilichamen tegen R.solanacearum in PBS (aanhangsel 4) met 0,5 % bovien serumalbumine (BSA) en doe 190 ~l in elk putje. Incubeer 2 uur bij 37 ° C. 5) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).6) Bereid een geschikte verdunning van conjugaat van anti-muis-immunoglobulines met alkalische fosfatase in PBS.Doe 190 ~l in elk putje. Incubeer 2 uur bij 37 ° C. 7) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).8) Bereid een oplossing van alkalischefosfatasesubstraat met 1 mg p-nitrofenylfosfaat per ml substraatbuffer (aanhangsel 4).Doe 200 µl in elk putje. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en lees gedurende 90 minuten periodiek de extinctie bij 40 nm af.

Interpretatie van de ELISA-testresultaten De ELISA-test is negatief als de gemiddelde optische dichtheid (OD) in de duplomonsterputjes kleiner is dan 2 x OD in het putje met de negatieve monsterextractcontrole, mits de OD voor de positieve controles altijd groter is dan 1,0 (na 90 minuten incubatie met substraat) en groter is dan 2 x OD voor de negatieve monsterextracten.

De ELISA-test is positief als de gemiddelde OD in de duplomonsterputjes groter is dan 2 x OD voor het negatieve monsterextract, mits de OD in elk putje voor negatieve controle kleiner is dan 2 x OD voor de positieve controles.

Negatieve ELISA-aflezingen in putjes voor positieve controle wijzen op een slechte uitvoering of op remming van de test. Positieve ELISA-aflezingen in putjes voor negatieve controle wijzen op kruisbesmetting of niet-specifieke antilichaambinding. 9. Bioassay NB : Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten 103-104 kolonievormende eenheden R.solanacearum per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden (voor de bereiding zie aanhangsel 3).

De grootste detectiegevoeligheid wordt verkregen met vers bereid monsterextract en optimale groeicondities. De methode kan echter ook goed worden toegepast op extracten die tussen - 68 en - 86 ° C in glycerol zijn bewaard.

Het volgende protocol is gebaseerd op Janse (1988). 9.1. Neem voor elk monster tien testplanten van een vatbaar tomatenras (bv. Moneymaker of een door het testlaboratorium even vatbaar bevonden ras) in het volgroeid 3-bladstadium. Voor nadere bijzonderheden over de teelt zie aanhangsel 8. Aubergines (bv. Black Beauty of een even vatbaar ras) in het 2- tot volgroeid 3-bladstadium kunnen ook worden gebruikt. De symptomen zijn bij aubergines minder ernstig en ontwikkelen zich trager. Gebruik daarom zo mogelijk tomatenplanten. 9.2. Verdeel 100 µl monsterextract over de testplanten. 9.2.1. Injectie-inoculatie Inoculeer de stengels net boven de zaadlobben met een injectiespuit voorzien van een hypodermische naald (minimaal 23G). Verdeel het monster over de testplanten. 9.2.2. Snede-inoculatie Houd de plant tussen twee vingers en pipetteer een druppel (5-10 ~l) gesuspendeerde pellet op de stengel tussen de zaadlobben en het eerste blad.

Maak met een steriel scalpel vanaf de pelletdruppel een diagonale snede van ongeveer 1,0 cm lang en ongeveer 2/3 van de stengeldikte diep.

Stop de snede dicht met steriele vaseline uit een injectiespuit. 9.3. Inoculeer met dezelfde techniek vijf zaailingen met een waterige suspensie van 105-106 cellen/ml, bereid uit een 48 uur oude kweek van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 als positieve controle en met pelletbuffer (aanhangsel 4) als negatieve controle. Houd de positieve en negatieve controleplanten gescheiden van de andere om kruisbesmetting te vermijden. 9.4. Teelt de testplanten maximaal vier weken in quarantaine bij 25-30 ° C en hoge luchtvochtigheid met aangepaste bewatering zodat geen oververzadiging of verwelking optreedt. Incubeer positieve en negatieve controleplanten op van elkaar gescheiden plaatsen in een broeikas of groeikamer om contaminatie te vermijden; is dat wegens ruimtegebrek niet mogelijk, zorg er dan voor dat de verschillende behandelingen strikt gescheiden gehouden worden. Als planten voor verschillende monsters dicht bij elkaar geïncubeerd moeten worden, moeten ze met geschikte schermen gescheiden gehouden worden. Bij het bemesten, bewateren en onderzoeken en bij alle overige handelingen moet de uiterste zorg in acht genomen worden om kruisbesmetting te vermijden. De kassen en groeikamers moeten absoluut vrij van insecten gehouden worden, aangezien die de bacterie van het ene monster naar het andere kunnen overbrengen.

Let op symptomen van verwelking, epinastie, chlorose en/of verminderde groei. 9.5. Isoleer reinculturen die vermoedelijk uit R. solanacearum bestaan uit geïnfecteerde planten (II.3) en identificeer ze (VI. B). 9.6. Als na drie weken geen symptomen zijn waargenomen, voer dan een IF-, PCR- of isolatietest uit op een samengesteld monster van stengeldelen van 1 cm lang van elke testplant, die boven de inoculatieplaats zijn afgesneden. Als de test positief is, verdunnen en uitplaten (4.1). 9.7. Identificeer eventuele reinculturen die vermoedelijk uit R. solanacearum bestaan (VI. B).

Interpretatie van het resultaat van de bioassay De met de bioassay verkregen resultaten zijn valide als de planten van de positieve controle karakteristieke symptomen vertonen, de bacteriën weer uit deze planten geïsoleerd kunnen worden en op de negatieve controles geen symptomen worden gevonden.

De bioassay is negatief als de testplanten niet met R. solanacearum geïnfecteerd zijn, mits R. solanacearum in de positieve controles wel wordt gedetecteerd.

De bioassay is positief als de testplanten wel met R. solanacearum geïnfecteerd zijn.

B. IDENTIFICATIETESTS Identificeer reinculturen van vermoedelijke R. solanacearum-isolaten aan de hand van ten minste twee van de volgende, op verschillende biologische principes gebaseerde tests.

Voorzover van toepassing moet elke test ook worden uitgevoerd op bekende referentiestammen (aanhangsel 3). 1. Voedingstests en enzymatische identificatietests Bepaal de volgende fenotypische eigenschappen, die universeel aan- dan wel afwezig zijn in R.solanacearum, volgens de methoden van Lelliott en Stead (1987), Klement e.a. (1990) en Schaad (2001) :

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. IF-test 2.1. Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in IF-buffer (aanhangsel 4). 2.2. Bereid een tweevoudige verdunningsreeks van een geschikt antiserum. 2.3. Pas de IF-procedure toe (VI.A.5). 2.4. De IF-test is positief als de IF-titer van de kweek gelijkwaardig is aan die van de positieve controle. 3. ELISA-test NB : Als naast deze test slechts één andere identificatietest wordt uitgevoerd, mag dat geen serologische test zijn. 3.1. Bereid een suspensie van ongeveer 108 cellen/ml in 1X PBS (aanhangsel 4). 3.2. Voer een geschikte ELISA-procedure uit met een specifiek monoklonaal antilichaam tegen R. solanacearum. 3.3. De ELISA-test is positief als de ELISA-aflezing voor de cultuur ten minste de helft van die voor de positieve controle bedraagt. 4. PCR-tests 4.1. Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in steriel water van moleculair-biologische kwaliteit. 4.2. Verwarm 100 µl van de celsuspensie 4 minuten in gesloten buisjes in een verwarmingsblok of waterbad bij 100 ° C. Hierna kunnen de monsters bij - 16 tot - 24 ° C worden opgeslagen tot zij nodig zijn. 4.3. Pas geschikte PCR-procedures toe voor de amplificatie van voor R. solanacearum specifieke amplicons (bv. Seal e.a. (1993), Pastrik en Maiss (2000), Pastrik e.a. (2002), Boudazin e.a. (1999), Opina e.a. (1997), Weller e.a. (1999)). 4.4. De identificatie van R. solanacearum is positief als de PCR-amplicons van dezelfde lengte zijn en dezelfde restrictiefragmentlengtepolymorfismen hebben als bij de positieve controlestam. 5. FISH-test 5.1. Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in UPW. 5.2. Voer de FISH-procedure uit (VI.A.7) met ten minste twee R. solanacearum-specifieke oligo-probes (aanhangsel 7). 5.3. De FISH-test is positief als de kweek en de positieve controle dezelfde reacties vertonen. 6. Vetzuurprofiel (FAP) 6.1. Laat de kweek 48 uur bij 28 ° C groeien op trypticasesoja-agar (Oxoid). 6.2. Voer een geschikte FAP-procedure uit (Janse (1991), Stead (1992)). 6.3. De FAP-test is positief als het profiel van de vermoedelijke cultuur identiek is aan dat van de positieve controle. De aanwezigheid van kenmerkende vetzuren (14 :0 3OH, 16 :0 2OH, 16 :1 2OH en 18 :1 2OH) en de afwezigheid van 16:0 3OH wijzen sterk op Ralstonia sp. 7. Stamkarakterisatie Voor elke nieuwe isolatie van R.solanacearum wordt stamkarakterisatie met een van de volgende methoden aanbevolen.

Voorzover van toepassing moet elke test ook worden uitgevoerd op bekende referentiestammen (aanhangsel 3). 7.1. Biovarbepaling R. solanacearum wordt ingedeeld in biovars op basis van het vermogen drie disachariden en twee hexosealcoholen te assimileren of oxideren (Hayward (1964), Hayward e.a. (1990)). Het kweekmedium voor de biovartest staat in aanhangsel 2. Voer de test uit door steekenting van het medium met reinculturen van isolaten van R. solanacearum en incubatie bij 28 ° C. Breng het medium over op steriele platen met 96 putjes (200 µl per putje). De test is positief bij een verkleuring van olijfgroen naar geel binnen 72 uur.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 7.2. Genetische vingerafdruk Er zijn diverse technieken voor moleculaire differentiatie van stammen van R. solanacearum, waaronder : 7.2.1. RFLP-analyse (restriction fragment length polymorphism, polymorfisme van de lengte van restrictiefragmenten) (Cook e.a. (1989)); 7.2.2. PCR van repetitieve DNA-sequenties met REP-, BOX- en ERIC-primers (Louws e.a. (1995), Smith e.a. (1995)); 7.2.3. AFLP-analyse (amplified fragment length polymorphism, polymorfisme van de lengte van geamplificeerde fragmenten) (Van der Wolf e.a. (1998)). 7.3. PCR-methoden Specifieke PCR-primers (Pastrik e.a. (2002), zie aanhangsel 6) kunnen worden gebruikt om een onderscheid te maken tussen stammen van groep 1 (biovars 3, 4, 5) en 2 (biovars 1, 2A, 2T) van R. solanacearum, zoals oorspronkelijk bepaald met RFLP-analyse (Cook e.a. (1989)) en analyse van de 16S-rDNA-sequentie (Taghavi e.a. (1996)).

C. BEVESTIGINGSTEST De pathogeniteitstest moet worden uitgevoerd voor de definitieve bevestiging van een diagnose van R. solanacearum en voor de bepaling van de virulentie van culturen die als R. solanacearum geïdentificeerd zijn. 1) Bereid een inoculum van ongeveer 106 cellen/ml van een 24-48 uur oude kweek van het te testen isolaat en van een geschikte positieve controlestam van R.solanacearum (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3). 2) Inoculeer vijf à tien vatbare tomaten- of aubergineplanten in het volgroeid 3-bladstadium (VI.A.9). 3) Incubeer maximaal twee weken bij 25-28 ° C en hoge luchtvochtigheid met aangepaste bewatering om oververzadiging en droogtestress te voorkomen.Met reinculturen treedt binnen 14 dagen een typische verwelking op. Als er dan nog geen symptomen zijn, kan niet worden bevestigd dat het om een pathogene vorm van R. solanacearum gaat. 4) Let op symptomen van verwelking, epinastie, chlorose en verminderde groei.5) Neem voor de isolatie een stuk stengel van symptomatische planten ongeveer 2 cm boven het inoculatiepunt.Maak dit fijn en suspendeer het in een klein volume steriel gedestilleerd water of steriele fosfaatbuffer 50 mM (aanhangsel 4). Maak een isolaat uit de suspensie door uitplaten van verdunningen of uitstrijken op een geschikt, bij voorkeur selectief medium (aanhangsel 2). Incubeer 48-72 uur bij 28 ° C en kijk of er karakteristieke R. solanacearum-kolonies verschijnen.

Aanhangsel 1 Bij de optimalisering en validering van de protocollen ingeschakelde laboratoria

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Aanhangsel 2 Isolatie- en kweekmedia voor R. solanacearum

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld NB : 1. Wijziging van de samenstelling van de media kan de groei van R. solanacearum hinderen. 2. In plaats van Bacto-Agar (Difco) kan Agar No.1 (Oxoid) worden gebruikt. R. solanacearum groeit dan trager, maar concurrerende saprofyten kunnen ook worden geremd. Het kan 1-2 dagen langer duren voor R. solanacearum karakteristieke kolonies vormt en de rode verkleuring kan lichter en diffuser zijn dan op Bacto-Agar. 3. Een verhoging van de bacitracineconcentratie tot 2 500 U/l kan concurrerende bacteriepopulaties remmen zonder de groei van R. solanacearum te hinderen.

Media en geconcentreerde antibioticaoplossingen in het donker bij 4 ° C bewaren en binnen de maand gebruiken.

De platen moeten voor gebruik vrij zijn van condens.

Droog ze echter niet te veel.

Controleer de kwaliteit van elke nieuw bereide charge medium door een suspensie van een referentiecultuur van R. solanacearum uit te platen (aanhangsel 3) en te kijken of na 2-5 dagen incubatie bij 28 ° C karakteristieke kolonies verschijnen. c) Gevalideerde ophopingsmedia SMSA-bouillon (Elphinstone e.a. (1996)) Zelfde recept als selectief agarmedium SMSA, maar zonder Bacto-Agar en 2,3,5-tetrazoliumchloride.

Gemodificeerde Wilbrink-bouillon (Caruso e.a. (2002)) Sucrose10 g Proteosepepton 5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 0,25 g NaNO3 0,25 g Gedestilleerd water 1 l Steriliseer in de autoclaaf (15 minuten, 121 ° C) en laat afkoelen tot 50 ° C. Voeg dezelfde antibioticavoorraadoplossingen toe als voor SMSA-bouillon.

Aanhangsel 3 A. In de handel verkrijgbaar gestandaardiseerd controlemateriaal a) Bacterie-isolaten Als standaardreferentie voor positieve controle (tabel 1) of bij de optimalisering van de tests om kruisbesmetting te voorkomen (tabel 2) worden de volgende bacterie-isolaten aanbevolen.Alle stammen zijn verkrijgbaar bij : 1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, VK;2. Cultuurcollectie van de Plantenziektenkundige Dienst, Wageningen, Nederland;3. Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA, Station de Phytobactériologie, Angers, Frankrijk. Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld b) In de handel verkrijgbaar gestandaardiseerd controlemateriaal Het onderstaande controlemateriaal is verkrijgbaar bij de NCPPB Gevriesdroogde pellet van extract van 200 gezonde aardappelknollen, als negatieve controle voor alle tests. Gevriesdroogde pellet van extract van 200 gezonde aardappelknollen met 103-104 of 104-106 cellen R. solanacearum biovar 2 (stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857), als positieve controle voor serum- en PCR-tests.

Niet geschikt als standaardcontrole voor isolatietests of bioassays, aangezien vriesdrogen de levensvatbaarheid van de cellen aantast.

Met formaline gefixeerde suspensies van 106 cellen/ml R. solanacearum biovar 2 (stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857), als positieve controle voor serumtests.

B. Bereiding van positieve en negatieve controles voor de screeningstests (PCR/IF en FISH) Maak een 48 uur oude cultuur van een virulente stam van R. solanacearum ras 3/biovar 2 (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) op SMSA-basismedium en suspendeer deze in 10 mM fosfaatbuffer tot een celdichtheid van ongeveer 2 x 108 kve/ml. Dit wordt meestal bereikt met een licht troebele suspensie met een optische dichtheid van 0,15 bij 600 nm.

Neem stukjes uit het naveleinde van 200 knollen van een partij aardappelen met blanke schil waarvan bekend is dat deze vrij zijn van R. solanacearum.

Verwerk de stukjes op de gebruikelijke wijze en resuspendeer de pellet in 10 ml.

Doe in tien steriele microvaatjes van 1,5 ml telkens 900 µl geresuspendeerde pellet.

Breng 100 µl van de suspensie van R. solanacearum over in het eerste microvaatje. Vortex.

Doe in de volgende vijf microvaatjes telkens een decimale verdunning.

De zes microvaatjes met bacteriën worden als positieve controle gebruikt. De vier microvaatjes zonder bacteriën worden als negatieve controle gebruikt. Etiketteer de microvaatjes als zodanig.

Doe aliquots van 100 µl in steriele microvaatjes van 1,5 ml om van elk controlemonster negen duplicaten te maken. Bewaar deze tussen - 16 en - 24 ° C tot gebruik.

De aanwezigheid en concentratie van R. solanacearum in de controlemonsters moet eerst met IF bevestigd worden.

Doe voor de PCR-test bij elke reeks analysemonsters een DNA-extractie van de positieve en negatieve controlemonsters.

Test voor de IF- en de FISH-test bij elke reeks analysemonsters ook de positieve en negatieve controlemonsters.

Bij de IF-, FISH- en PCR-tests moet R. solanacearum ten minste worden gedetecteerd in de positieve controles met 106 en 104 cellen/ml en mag de bacterie in geen van de negatieve controles worden gedetecteerd.

Aanhangsel 4 Buffers voor testprocedures ALGEMEEN : Ongeopende gesteriliseerde buffers kunnen maximaal een jaar bewaard worden.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Aanhangsel 5 Bepaling van het besmettingsniveau met de IF- en de FISH-test 1. Tel het gemiddelde aantal typische fluorescerende cellen per veld (c).2. Bereken het aantal typische fluorescerende cellen per venstertje van het objectglaasje (C). C = c x S/s waarbij S = oppervlakte van een venstertje van het objectglaasje en s = oppervlakte van het objectiefveld s = {pi}i2/4G2K2 waarbij : i = veldcoëfficiënt (tussen 8 en 24, afhankelijk van het type oculair), K = buiscoëfficiënt (1 of 1,25), G = vergrotingsfactor (100x, 40x enz.) van het objectief 3. Bereken het aantal typische fluorescerende cellen per ml geresuspendeerde pellet (N). N = C x 1 000/y x F waarbij y = volume van de geresuspendeerde pellet op het venster, en F = verdunningsfactor van de geresuspendeerde pellet.

Aanhangsel 6 Gevalideerde PCR-protocollen en -reagentia NB : Bij de voorbereidende tests moeten 103-104 cellen R. solanacearum per ml monsterextract reproduceerbaar gedetecteerd worden. De voorbereidende tests mogen verder geen fout-positieve uitslagen vertonen bij een selectie van bacteriestammen (aanhangsel 3). 1. PCR-protocol van Seal e.a. (1993) 1.1. Oligonucleotide-primers Forward primer OLI- 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3' Reverse primer Y-2 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3' Verwachte ampliconlengte voor template-DNA van R. solanacearum = 288 bp 1.2. PCR-reactiemix

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 1.3. PCR-reactiecondities Werk het volgende programma af : 1 cyclus van : i) 2 minuten bij 96 ° C (denaturatie van het template-DNA) 35 cycli van ii) 20 seconden bij 94 ° C (denaturatie van het template-DNA) iii) 20 seconden bij 68 ° C (annealing van de primers) iv) 30 seconden bij 72 ° C (extensie van de kopie) 1 cyclus van : v) 10 minuten bij 72 ° C (laatste extensie) vi) koeling op 4 ° C. NB : Dit programma is geoptimaliseerd voor een Perkin Elmer 9600 thermal cycler. Bij gebruik van andere modellen moet de duur van de cycli ii), iii) en iv) wellicht gewijzigd worden. 1.4. Restrictie-enzymanalyse van de amplicons Uit DNA van R. solanacearum geamplificeerde PCR-producten leveren met het enzym Ava II na incubatie bij 37 ° C een kenmerkend polymorfisme van de restrictiefragmentlengte op. 2. PCR-protocol van Pastrik en Maiss (2000) 2.1. Oligonucleotide-primers Forward primer Ps-1 5'-agt cga acg gca gcg ggg g-3' Reverse primer Ps-2 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3' Verwachte ampliconlengte voor template-DNA van R. solanacearum = 553 bp. 2.2. PCR-reactiemix

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2.3. PCR-reactiecondities Werk het volgende programma af : 1 cyclus van :i) 5 minuten bij 95 ° C (denaturatie van het template-DNA) 35 cycli van ii) 30 seconden bij 95 ° C (denaturatie van het template-DNA) iii) 30 seconden bij 68 ° C (annealing van de primers) iv) 45 seconden bij 72 ° C (extensie van de kopie) 1 cyclus van : v) 5 minuten bij 72 ° C (laatste extensie) vi) koeling op 4 ° C. NB : Dit programma is geoptimaliseerd voor een MJ Research PTC 200 thermal cycler. Bij gebruik van andere modellen moet de duur van de cycli ii), iii) en iv) wellicht gewijzigd worden. 2.4. Restrictie-enzymanalyse van de amplicons Uit DNA van R. solanacearum geamplificeerde PCR-producten leveren met het enzym Taq I na 30 minuten incubatie bij 65 ° C een kenmerkend polymorfisme van de restrictiefragmentlengte op. De uit R. solanacearum-specifiek fragment verkregen restrictiefragmenten zijn 457 en 96 bp lang. 3. Multiplex-PCR-protocol met interne PCR-controle (Pastrik e.a. (2002)) 3.1. Oligonucleotide-primers Forward primer RS-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3' Reverse primer RS-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3' Forward primer NS-5-F 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3' Reverse primer NS-6-R 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3' Verwachte ampliconlengte voor template-DNA van R. solanacearum = 718 bp (RS-primerset).

Verwachte ampliconlengte voor de 18S rRNA interne PCR-controle = 310 bp (NS-primerset). 3.2. PCR-reactiemix

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 3.3. PCR-reactiecondities Werk het volgende programma af : 1 cyclus van : i) 5 minuten bij 95 ° C (denaturatie van het template-DNA) 35 cycli van : ii) 30 seconden bij 95 ° C (denaturatie van het template-DNA) iii) 30 seconden bij 58 ° C (annealing van de primers) iv) 45 seconden bij 72 ° C (extensie van de kopie) 1 cyclus van : v) 5 minuten bij 72 ° C (laatste extensie) vi) koeling op 4 ° C. NB : Dit programma is geoptimaliseerd voor een MJ Research PTC 200 thermal cycler. Bij gebruik van andere modellen moet de duur van de cycli ii), iii) en iv) wellicht gewijzigd worden. 3.4. Restrictie-enzymanalyse van de amplicons Uit DNA van R. solanacearum geamplificeerde PCR-producten leveren met het enzym Bsm I of een isoschizomeer (bv. Mva 1269 I) na 30 minuten incubatie bij 65 ° C een kenmerkend polymorfisme van de restrictiefragmentlengte op. 4. Biovar-specifiek PCR-protocol voor R.solanacearum (Pastrik e.a. (2001)) 4.1. Oligonucleotide-primers Forward primer Rs-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3' Reverse primer Rs-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3' Reverse primer Rs-3-R 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3' Verwachte ampliconlengte voor template-DNA van R. solanacearum : met Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp; met Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp. 4.2. PCR-reactiemix

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 4.3. PCR-reactiecondities Werk het volgende programma af, zowel voor biovar 1/2 als voor biovar 3/4/5 : 1 cyclus van : i) 5 minuten bij 95 ° C (denaturatie van het template-DNA) 35 cycli van : ii) 30 seconden bij 95 ° C (denaturatie van het template-DNA) iii) 30 seconden bij 58 ° C (annealing van de primers) iv) 45 seconden bij 72 ° C (extensie van de kopie) 1 cyclus van : v) 5 minuten bij 72 ° C (laatste extensie) vi) koeling op 4 ° C. NB : Dit programma is geoptimaliseerd voor een MJ Research PTC 200 thermal cycler. Bij gebruik van andere modellen moet de duur van de cycli ii), iii) en iv) wellicht gewijzigd worden. 4.4. Restrictie-enzymanalyse van de amplicons Met de primers Rs-1-F en Rs-1-R uit DNA van R. solanacearum geamplificeerde PCR-producten leveren met het enzym Bsm I of een isoschizomeer (bv. Mva 1269 I) na 30 minuten incubatie bij 65 ° C een kenmerkend polymorfisme van de restrictiefragmentlengte op. Met de primers Rs-1-F en Rs-3-R uit DNA van R. solanacearum geamplificeerde PCRproducten hebben geen restrictiesites. 5. Bereiding van de laadbuffer 5.1. Broomfenolblauw (10 %, voorraadoplossing) Broomfenolblauw 5 g Gedestilleerd water (bidest) 50 ml 5.2. Laadbuffer Glycerol (86 %) 3,5 ml Broomfenolblauw (zie 5.1) 300 µl Gedestilleerd water (bidest) 6,2 ml 6. 10X TAE-buffer (Tris-acetaat-EDTA), pH 8,0 Tris-buffer 48,40 g IJsazijn 11,42 ml EDTA (dinatriumzout) 3,72 g Gedestilleerd water 1,00 l Verdun tot 1x voor gebruik. De buffer is ook in de handel verkrijgbaar (bv. Invitrogen of gelijkwaardig).

Aanhangsel 7 Gevalideerde reagentia voor de FISH-test 1. Oligo-probes R.solanacearum-specifieke probe OLI-1-CY3 : 5'-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3' Niet-specifieke eubacteriële probe EUB-338-FITC : 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3' 2. Fixatief [LET OP! HET FIXATIEF BEVAT HET GIFTIGE PARAFORMALDEHYDE.DRAAG HANDSCHOENEN EN ADEM DE DAMPEN NIET IN. WERK IN EEN ZUURKAST.] i) Verwarm 9 ml water van moleculair-biologische kwaliteit (bv. ultrazuiver water, UPW) tot ongeveer 60 ° C en voeg 0,4 g paraformaldehyde toe. Het paraformaldehyde lost op na toevoeging van 5 druppels NaOH 1 N en roeren met een magneetroerder. ii) Breng de pH op 7,0 door toevoegen van 1 ml fosfaatbuffer (PB) 0,1 M (pH 7,0) en 5 druppels HCl 1 N. Controleer de pH met indicatorpapier en corrigeer zo nodig met HCl of NaOH. [LET OP! GEBRUIK GEEN PH-METER IN OPLOSSINGEN DIE PARAFORMALDEHYDE BEVATTEN.] iii) Filtreer de oplossing over een membraanfilter van 0,22 ~m en bewaar stofvrij bij 4 ° C tot gebruik. 3. 3X hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (gefiltersteriliseerd en geautoclaveerd) 15 mM Verdun tot 1X voor gebruik.4. Hybridisatieoplossing 1X hybmix Natriumdodecylsulfaat (SDS) 0,01 % Formamide 30 %, probe EUB 338 5 ng/µl probe OLI-1 of OLI-2 5 ng/µl Bereid hoeveelheden hybridisatieoplossing zoals in tabel 1 aangegeven. Voor elk objectglaasje (dat twee verschillende monsters in duplo bevat) is 90 µl hybridisatieoplossing nodig. BELANGRIJK : FORMAMIDE IS ZEER GIFTIG. DRAAG HANDSCHOENEN EN NEEM VOORZORGEN!

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 5. 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Gedestilleerd water 1,00 l Los de ingrediënten op, controleer de pH en steriliseer in de autoclaaf (15 minuten, 121 ° C). Aanhangsel 8 Aubergine- en tomatenteelt Zaai zaad van tomatenplanten (Lycopersicon esculentum) of aubergineplanten (Solanum melongena) in gepasteuriseerde zaaigrond.

Zaailingen met volledig ontwikkelde zaadlobben (10-14 dagen) worden overgepoot in gepasteuriseerde potgrond.

Teel de aubergine- of tomatenplanten voor de inoculatie in een kas met de volgende omgevingsomstandigheden : daglengte : 14 uur of natuurlijke daglengte indien groter; temperatuur : overdag : 21-24 ° C, 's nachts : 14-18 ° C;

Vatbaar tomatenras : "Moneymaker";

Vatbaar aubergineras : "Black Beauty";

LITERATUURVERWIJZINGEN 1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990.

Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172 : 762-770. 2. Anon.1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. 3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999.

Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. 4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. 5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum : detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. 6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996.

Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. 7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In : A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. 8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum.

Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. 9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum.Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. 10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. 11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. 12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis.

Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. 13. Kelman, A.1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium.

Phytopathology 44; 693-695. 14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. 15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. 16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In : H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. 17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR.Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. 18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCRfingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv.vesicatoria.

Phytopathology 85; 528-536. 19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac.

J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. 20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. 21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. 22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt.Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. 23. Schaad, W.2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota : 373 pp. 24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993.

Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing : construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139 : 1587-1594. 25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995.

Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. 26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. 27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. 28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In : Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease : Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. 29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay.

Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. 30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64 : 4546-4554.

Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE

Bijlage III Biologisch testmateriaal 1. Bij elke vermoede aanwezigheid van het organisme waarvoor bij de screeningtest(s) volgens de in bijlage II beschreven methoden voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en voor alle andere gevallen een positieve reactie werd vastgesteld die volgens die methoden moet worden bevestigd of ontkend moet het volgende worden bijgehouden en in gepaste omstandigheden bewaard tot die methoden volledig zijn uitgevoerd : a) alle bemonsterde knollen en voor zover mogelijk alle bemonsterde planten, b) het resterende extract en de daarbij gemaakte preparaten voor de screeningtests, bijvoorbeeld de immunofluorescentiepreparaten en c) alle relevante documentatie Waar nodig kunnen rassenproeven worden gedaan op de bewaarde knollen. 2. Als de aanwezigheid van het organisme wordt bevestigd, moet het volgende worden bijgehouden en in gepaste omstandigheden bewaard : a) het in punt 1 bedoelde materiaal en b) indien nodig een monster van de door inoculatie van het knol- of plantenextract besmette tomaat of aubergine, en c) de geïsoleerde cultuur van het organisme gedurende ten minste een maand na kennisgeving aan de andere lidstaten en aan de Europese Commissie van de conform artikel 5, § 1, verklaarde besmetting Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE

Bijlage IV Bepaling van de omvang en van de primaire oorsprong van de besmetting Het in artikel 5, § 1, punt a) i) bedoelde onderzoek omvat, voorzover van toepassing, de volgende elementen : i) de productieplaatsen waar : a) aardappelen worden of zijn geteeld die klonaal verwant zijn aan de aardappelen waarvan is geconstateerd dat ze met het organisme besmet zijn, b) tomaten worden of zijn geteeld uit dezelfde bron als die van de tomaten die met het organisme besmet blijken te zijn, c) aardappelen of tomaten worden of zijn geteeld die onder officieel toezicht zijn geplaatst omdat vermoed wordt dat het organisme erop voorkomt, d) aardappelen worden of zijn geteeld die klonaal verwant zijn aan de aardappelen die zijn geteeld op productieplaatsen waarvan is vastgesteld dat ze besmet zijn met het organisme, e) aardappelen of tomaten worden of zijn geteeld en die dicht bij productieplaatsen liggen die besmet zijn of rechtstreeks of via loonwerkbedrijven in contact kunnen zijn geweest met dezelfde landbouwmachines of productievoorzieningen, f) voor irrigatie of beregening oppervlaktewater wordt gebruikt waarvan vermoed wordt of bevestigd is dat het besmet is met het organisme, g) voor irrigatie of beregening oppervlaktewater wordt gebruikt dat ook wordt gebruikt op productieplaatsen waarvan vermoed wordt dat ze met het organisme besmet zijn, h) overstroming plaatsvindt of heeft plaatsgevonden met oppervlaktewater waarvan vermoed wordt of bevestigd is dat het met het organisme is besmet en ii) oppervlaktewater voor irrigatie, beregening of overstroming van velden of productieplaatsen waarvan bevestigd is dat ze met het organisme besmet zijn. Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE

Bijlage V Bepaling van de omvang van de waarschijnlijke besmetting en van de mogelijke besmetting Bepaling van de omvang van de waarschijnlijke besmetting 1. Voor het bepalen van de omvang van de waarschijnlijke besmetting als bedoeld in artikel 5, § 1, a) iii) en c) iii), moet rekening worden gehouden met de volgende elementen : a) in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat is geteeld op een krachtens artikel 5, § 1, a) ii) besmet verklaarde productieplaats, b) productieplaatsen die in contact kunnen zijn geweest met in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat krachtens artikel 5, § 1, a) ii) besmet is verklaard of die rechtstreeks of via loonwerkbedrijven in contact kunnen zijn geweest met dezelfde landbouwmachines of faciliteiten, c) in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat op de in b) bedoelde productieplaatsen is geteeld of daar aanwezig was in de periode waarin krachtens artikel 5, § 1, a) ii) besmet verklaard in de lijst opgenomen plantaardig materiaal aanwezig was op in a) bedoelde productieplaatsen, d) plaatsen waar in de lijst opgenomen plantaardig materiaal afkomstig uit in a) tot c) bedoelde productieplaatsen wordt behandeld, e) machines, voertuigen, gebouwen, opslagplaatsen of delen daarvan en alle andere voorwerpen, verpakkingsmateriaal inbegrepen, die met krachtens artikel 5, § 1, a) ii) besmet verklaard in de lijst opgenomen plantaardig materiaal in contact kunnen zijn geweest, f) in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat is opgeslagen in of in contact is geweest met in e) genoemde voorwerpen of inrichtingen voordat deze waren gereinigd of ontsmet, g) op grond van de in artikel 5, § 1, a) i) bedoelde onderzoeken en tests, voor aardappelen, alle knollen of planten met een klonale verwantschap via zuster- of uitgangsmateriaal met, en voor tomaat, alle planten uit dezelfde bron als in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat krachtens artikel 5, § 1, a) ii), besmet is verklaard en waarvoor besmetting via een klonaal verband waarschijnlijk lijkt, ook bij een negatieve testuitslag.Er kunnen rassenproeven worden uitgevoerd om het ras van de besmette knollen en planten na te gaan, h) plaatsen waar in g) bedoeld in de lijst opgenomen plantaardig materiaal wordt geteeld, i) plaatsen waar in de lijst opgenomen plantaardig materiaal wordt geteeld en waar voor irrigatie of beregening water wordt gebruikt dat krachtens artikel 5, § 1, c) ii) besmet is verklaard, j) in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat is geproduceerd op velden die overstroomd zijn met oppervlaktewater waarvan bevestigd is dat het besmet is. Bepaling van de omvang van de mogelijke besmetting 2. Bij het bepalen van de mogelijke verspreiding als bedoeld in artikel 5, § 1, a) iv) en punt c) iii) wordt rekening gehouden met : i) in de gevallen bedoeld in artikel 5, § 1, a) iv), a) de nabijheid van andere plaatsen waarop in de lijst opgenomen plantaardig materiaal wordt geteeld, b) de gemeenschappelijke productie en het gemeenschappelijk gebruik van voorraden pootaardappelen, c) het gebruik op de productieplaatsen van oppervlaktewater voor irrigatie of beregening van in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, wanneer er gevaar is of is geweest van oppervlaktewaterafvoer vanaf, of overstroming van, krachtens artikel 5, § 1, a) ii) besmet verklaarde productieplaatsen; ii) in gevallen waarin het oppervlaktewater besmet is verklaard krachtens artikel 5, § 1, c) iii) : a) plaatsen waar in de lijst opgenomen plantaardig materiaal wordt geteeld die in de nabijheid liggen van, of kunnen worden overstroomd met, besmet verklaard oppervlaktewater, b) aparte irrigatiereservoirs waarin besmet verklaard oppervlaktewater kan zijn terechtgekomen;c) waterlichamen die in verbinding staan met besmet verklaard oppervlaktewater, met inachtneming van : 1° stroomrichting en -snelheid van het besmet verklaarde water;2° de aanwezigheid in het wild van waardplanten van de nachtschadefamilie. Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE

Bijlage VI Bijzondere bestrijdingsmaatregelen Maatregelen voor het verwijderen van besmet verklaarde knollen en planten 1. De in artikel 6, § 1, bedoelde maatregelen betreffende de verwijdering onder toezicht van het Agentschap van krachtens artikel 5, § 1, a) ii) besmet verklaard plantaardig materiaal zijn : a) gebruik als diervoeder na een warmtebehandeling die het risico dat het organisme overleeft, uitsluit, of b) afvoer naar een officieel erkende stortplaats waar er geen aanwijsbaar risico is dat het organisme zich in het milieu verspreidt, bijvoorbeeld door lekkage naar landbouwgrond of contact met water dat voor de beregening van landbouwgronden kan worden gebruikt, of c) verbranding, of d) industriële verwerking door rechtstreekse en onmiddellijke levering aan verwerkingsbedrijven die over officieel erkende, adequate afvalverwijderingsinstallaties beschikken waarvan is vastgesteld dat er geen aanwijsbaar risico van verspreiding van het organisme bestaat, en die over een systeem beschikken om ten minste de uitgaande voertuigen te reinigen en te ontsmetten, of e) andere maatregelen, op voorwaarde dat is vastgesteld dat er geen aanwijsbaar risico bestaat dat het organisme zich kan verspreiden;van deze maatregelen moet onder opgave van de redenen ervoor aan de Commissie en de andere lidstaten kennis worden gegeven.

Alle afvalstoffen die overblijven na of voortkomen uit de bovengenoemde behandelingen, worden door middel van officieel erkende methoden verwijderd overeenkomstig bijlage VII bij Richtlijn 98/57/EG betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Maatregelen met betrekking tot waarschijnlijk besmet verklaarde knollen en planten 2. Het geëigende gebruik of de geëigende verwijdering van in artikel 6, § 2 bedoeld in de lijst opgenomen plantaardig materiaal onder toezicht van het Agentschap waarbij moet worden gezorgd voor een adequate communicatie tussen het Agentschap en, waar nodig, de bevoegde officiële instanties van de betrokken lidstaten om te garanderen dat dergelijk toezicht te allen tijde plaatsvindt alsmede op voorwaarde van de toestemming van het Agentschap of, waar nodig, van de bevoegde officiële instantie van de lidstaat waar de aardappelen verpakt of verwerkt moeten worden, wat betreft de afvalverwijderingsinstallaties als bedoeld in het eerste en het tweede streepje van punt i) van bijlage VII bij richtlijn 98/57/EG van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 20 juli 1998 betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., omvat : i) voor aardappelknollen : a) gebruik als consumptieaardappelen, verpakt voor rechtstreekse levering en gebruik zonder enige herverpakking, op een locatie met adequate afvalverwijderingsinstallaties.Pootaardappelen mogen op die locatie alleen worden gehanteerd als dat gescheiden of na reiniging en ontsmetting gebeurt, of b) gebruik als aardappelen bestemd voor industriële verwerking, en bestemd voor rechtstreekse en onmiddellijke levering aan een verwerkingsbedrijf met adequate afvalverwijderingsinstallaties en een systeem voor reiniging en ontsmetting van ten minste de uitgaande voertuigen, of c) enige andere vorm van gebruik of verwijdering, mits vaststaat dat er geen aanwijsbaar risico bestaat dat het organisme zich verspreidt en onder voorbehoud van goedkeuring door het Agentschap of, desgevallend, door de bevoegde officiële instanties van de betrokken lidstaat of lidstaten; ii) voor andere plantendelen, met inbegrip van stengels en bladafval : a) vernietiging, of b) enige andere vorm van gebruik of verwijdering, mits vaststaat dat er geen aanwijsbaar risico bestaat dat het organisme zich verspreidt en onder voorbehoud van goedkeuring door het Agentschap. Ontsmettingsmethoden 3. Afdoende methoden om de in artikel 6, § 3 bedoelde voorwerpen besmettingvrij te maken, zijn reiniging en, waar nodig, ontsmetting, volgens methoden die ervoor zorgen dat er geen aanwijsbaar risico bestaat dat het organisme zich verspreidt;ze worden toegepast onder toezicht van het Agentschap.

Maatregelen in de afgebakende zone 4. De verschillende in artikel 6, § 4, bedoelde maatregelen die het Agentschap moet uitvoeren in de krachtens artikel 5, § 1, punt a) iv) en § 2 afgebakende zones zijn : 4.1. Wanneer productieplaatsen besmet werden verklaard conform artikel 1, § 1, a) ii) : a) in een krachtens artikel 5, paragraaf 1, punt a) ii) besmet verklaard veld of besmet verklaarde productie-eenheid voor beschutte teelt, hetzij : i) gedurende ten minste vier teeltjaren na de verklaarde besmetting : 1° maatregelen om de opslag van aardappel- en tomatenplanten alsook van andere waardplanten van het organisme, zoals onkruid van de nachtschadefamilie, te verwijderen en 2° een verbod op het planten van : I) knollen, planten of botanisch zaad van aardappelen, II) tomatenplanten en -zaad, III) al naargelang van de biologische eigenschappen van het organisme : - andere waardplanten, - Brassica spp.waarvoor een aanwijsbaar risico bestaat dat het organisme erin kan overleven, - gewassen waarvoor een aanwijsbaar risico bestaat dat het organisme zich van daaruit kan verspreiden, 3° in het eerste oogstjaar voor aardappelen of tomaten dat volgt op de in punt a), i) bedoelde periode en op voorwaarde dat het veld bij officiële inspecties in ten minste de twee opeenvolgende aan de opplant voorafgaande teeltjaren vrij is bevonden van opslag van aardappel- en tomatenplanten en van andere waardplanten, met inbegrip van onkruid van de nachtschadefamilie : I) voor aardappelen : uitsluitend de teelt van consumptieaardappelen wordt toegestaan, II) voor aardappelen en tomaat : de geoogste knollen of tomatenplanten worden, al naargelang van het geval, officieel getest volgens de in bijlage II beschreven procedure, III) in het oogstjaar voor aardappelen of tomaten dat volgt op de in II) bedoelde campagne en na een passende cyclus van vruchtwisseling van ten minste twee jaar als het gaat om de teelt van pootaardappelen, wordt er een officieel onderzoek als bedoeld in artikel 3, paragraaf 1 uitgevoerd, of ii) gedurende de vijf teeltjaren die volgen op het jaar van besmetverklaring : 1° er worden maatregelen getroffen om de opslag van aardappel- en tomatenplanten alsook van andere in het wild voorkomende waardplanten van het organisme, met inbegrip van onkruid van de nachtschadefamilie, te verwijderen, en 2° het veld wordt gedurende de eerste drie jaar hetzij volledig braakgelegd, hetzij gebruikt voor graanteelt al naargelang van het vastgestelde risico of als blijvend grasland dat herhaaldelijk kort wordt gemaaid of intensief wordt begraasd, hetzij gebruikt voor de productie van graszaad, en in de twee volgende jaren beplant met niet-waardgewassen waarvoor er geen aanwijsbaar risico is dat het organisme erin overleeft of zich van daaruit verspreidt, 3° in het eerste oogstjaar voor aardappelen of tomaten dat volgt op de in 2° ) bedoelde periode en mits het veld in ten minste de twee opeenvolgende aan de opplant voorafgaande teeltjaren bij officiële inspecties vrij is verklaard van opslag van aardappel- en tomatenplanten en van andere waardplanten, met inbegrip van onkruid van de nachtschadefamilie : I) voor aardappelen : de teelt van poot- en consumptieaardappelen wordt toegestaan, II) de geoogste aardappelknollen of de tomatenplanten worden getest volgens de in bijlage II beschreven procedure;b) op alle andere velden van de besmette productieplaats en mits ten overstaan van het Agentschap is aangetoond dat het risico dat de opslag van aardappel- en tomatenplanten en van in het wild voorkomende waardplanten van het organisme, met inbegrip van onkruid van de nachtschadefamilie, werd uitgeschakeld : i) in het teeltjaar dat volgt op de besmetverklaring, 1° ) verbod op het planten of zaaien van aardappelknollen, aardappelplanten, aardappelzaad of andere waardplanten van het organisme, of 2° ) voor aardappelknollen mag alleen gecertificeerd pootgoed worden geplant en dan nog uitsluitend voor de teelt van consumptieaardappelen, 3° ) voor tomatenplanten, uitsluitend planten verkregen van zaaizaad dat voldoet aan de criteria van het koninklijk besluit voor de teelt van tomatenvruchten, ii) in het tweede teeltjaar en ten minste in het derde teeltjaar dat volgt op de besmetverklaring : 1° ) voor aardappelen wordt uitsluitend de opplant toegestaan van gecertificeerde pootaardappelen voor de teelt van poot- of consumptieaardappelen, 2° ) voor tomaat wordt uitsluitend de opplant toegestaan van tomatenplanten afkomstig van zaad dat voldoet aan de criteria van het koninklijk besluit, iii) in elk van de in i) en ii) bedoelde teeltjaren worden maatregelen genomen om de opslag van aardappelplanten en van in het wild voorkomende waardplanten van het organisme, indien aanwezig, te verwijderen en wordt op passende tijdstippen een officiële inspectie van het gewas uitgevoerd en worden op elk aardappelveld officiële tests op de geoogste aardappelen uitgevoerd volgens de in bijlage II beschreven procedure;c) onmiddellijk na de besmetverklaring krachtens artikel 5, paragraaf 1, punt a) ii) en na het eerste daaropvolgende teeltjaar : i) alle machines en opslagfaciliteiten op de productieplaats die voor de aardappel- of tomatenteelt zijn gebruikt worden gereinigd en zo nodig ontsmet volgens de in punt 3 van deze bijlage bedoelde adequate methoden, ii) waar nodig worden officiële controles verricht op de beregenings- en bespuitingsprogramma's, inclusief het verbod van dergelijke programma's om verspreiding van het organisme te voorkomen;d) in een krachtens artikel 5, paragraaf 1, punt a) ii) besmet verklaarde productie-eenheid voor beschutte teelt waar het groeimedium volledig kan worden vervangen : i) het planten of zaaien van aardappelknollen, -planten of botanisch aardappelzaad of andere waardplanten van het organisme, met inbegrip van tomatenplanten en -zaad, wordt verboden tenzij in de productie-eenheid onder officieel toezicht maatregelen zijn genomen om het organisme uit te roeien en alle waardmateriaal te verwijderen, waarbij ten minste het groeimedium volledig is vervangen en de productie-eenheid en alle gereedschappen en machines zijn gereinigd en zo nodig ontsmet, en het Agentschap daarna toestemming heeft gegeven om er aardappelen of tomaten te telen, en ii) bij de aardappelteelt worden gecertificeerde pootaardappelen of miniknollen of microplanten van geteste bronnen gebruikt, iii) bij de tomatenteelt wordt uitsluitend zaad gebruikt dat voldoet aan de criteria van het koninklijk besluit of, in geval van vegetatieve vermeerdering, tomatenplanten die zijn verkregen uit dergelijk onder officieel toezicht geteeld zaad, iv) waar nodig worden officiële controles verricht op de beregenings- of bespuitingsprogramma's, inclusief het verbod op dergelijke programma's, om verspreiding van het organisme te voorkomen. 4.2. In de afgebakende zones moet het Agentschap, onverminderd de in punt 4.1 van deze bijlage genoemde maatregelen toepassen : a) ervoor zorgen dat alle machines en opslaginrichtingen op de productieplaats die bij de aardappel- of tomatenteelt zijn gebruikt, onmiddellijk na de besmetverklaring worden gereinigd en zo nodig ontsmet volgens de in punt 3 van deze bijlage beschreven adequate methoden;b) onmiddellijk en gedurende ten minste drie teeltjaren na de verklaarde besmetting : i) wanneer de afgebakende zone krachtens artikel 5, paragraaf 1, punt a) iv) is vastgesteld : 1° toezicht houden op de bedrijfsterreinen of -gebouwen waar aardappelknollen of tomaten worden geteeld, opgeslagen of gehanteerd, en op de ruimten van bedrijven die volgens contracten materiaal inzetten dat wordt gebruikt voor de productie van aardappelen of tomaten, 2° voorschrijven dat in die zone uitsluitend gecertificeerd pootgoed wordt gebruikt voor alle aardappelteelten in die zone en dat de pootaardappelen die worden geoogst op de productieplaatsen waarvan krachtens artikel 5, § 1, a), iii), werd vastgesteld dat zij waarschijnlijk besmet zijn, aan tests worden onderworpen, 3° voorschrijven dat in alle bedrijven binnen de zone de poot- en bewaaraardappelen gescheiden worden gehanteerd of dat een systeem van reiniging en zo nodig ontsmetting wordt toegepast tussen het hanteren van pootaardappelen en voorraden bewaaraardappelen, 4° bepalen dat bij de tomatenteelt in die zone uitsluitend tomaten worden geplant die afkomstig zijn van zaad dat voldoet aan de criteria van het koninklijk besluit, 5° een officieel onderzoek verrichten overeenkomstig artikel 3, § 1; ii) als oppervlaktewater conform artikel 5, § 1, punt c) ii) besmet is verklaard of conform artikel 5, § 1, c), ii) is opgenomen in de lijst van elementen die een rol kunnen spelen bij mogelijke verspreiding van het organisme conform bijlage V, punt 2 : 1° op geschikte tijdstippen een jaarlijks onderzoek uitvoeren, waarbij monsters van het oppervlaktewater en van de betreffende waardplanten van de nachtschadefamilie in de betreffende waterbronnen worden genomen en getest volgens de methoden in bijlage II voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en voor andere gevallen, 2° in de in artikel 6 § 2 bedoelde zones officiële controles uitvoeren op de beregenings- en bespuitingsprogramma's, conform hetgeen bepaald is in bijlage VII, 3° wanneer effluenten van vloeibaar afval besmet zijn, officiële controles uitvoeren op de afvoer van vast of vloeibaar afval van industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven waar in de lijst opgenomen plantaardig materiaal wordt behandeld;c) waar nodig een programma opstellen om alle pootaardappelvoorraden binnen een passende termijn te vervangen. Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE

Bijlage VII Afgebakende gebieden bij besmetting van het oppervlaktewater Binnen de in artikel 5 § 2 bedoelde gebieden : a) zijn de volgende maatregelen van toepassing : 1° het is verboden oppervlaktewater op enigerlei wijze te gebruiken bij de teelt van aardappelen, tomaten en aubergines;2° installaties of delen daarvan, die gebruikt worden voor het beregenen van andere dan aardappelteelten met oppervlaktewater, mogen niet in aanraking komen met aardappelpercelen;3° elke teler moet de volgende verplichtingen naleven : i) jaarlijks vóór 30 april door middel van een door het Agentschap vastgesteld formulier, aangifte doen van al zijn met aardappelen beteelde of te betelen percelen met een oppervlakte van meer dan 10 are.Die aangifte moet vergezeld gaan van (een) liggingsplan(nen) op schaal 1/10000 waarop deze aardappelpercelen aangeduid worden; ii) zich ertoe verbinden niet meer dan eenmaal om de drie jaar op dezelfde plaats aardappelen, pootaardappelen en primeuraardapplen inbegrepen, te verbouwen; iii) alvorens over te gaan tot het beregenen van een perceel aardappelen met ander water dan oppervlaktewater, de daartoe gebruikte installatie volledig en grondig te spoelen met ander water dan oppervlaktewater; iv) bij het beregenen van andere percelen dan aardappelpercelen met oppervlaktewater steeds alle nodige voorzorgen nemen om te beletten dat aardappelpercelen met dat oppervlaktewater in aanraking komen. b) In afwijking op het verbod bepaald in a), kan onder de verantwoordelijkheid van de teler voor de beregening van tomaten en aubergines oppervlaktewater afkomstig van een vergaarbekken worden gebruikt, op voorwaarde dat : i) de teler daartoe jaarlijks vóór 30 april een aangifte indient door middel van een door het Agentschap vastgesteld formulier, vergezeld van (een) liggingsplan(nen) op schaal 1/10000 waarop de te beregenen percelen en het te gebruiken vergaarbekken zijn aangeduid; ii) het betreffende vergaarbekken vrij is van waardplanten van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.; iii) het betreffende vergaarbekken uitsluitend gevuld wordt met grond- en/of regenwater, of het betreffende vergaarbekken gevuld is met oppervlaktewater dat er gedurende ten minste 48 uur in werd opgeslagen; iv) regelmatige analyses in een erkend laboratorium van onder toezicht van het Agentschap genomen oppervlaktewatermonsters aantonen dat er geen fytosanitair risico aanwezig is.

Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE