21 DECEMBER 2006. - Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 6 december 1978 betreffende de bestrijding van de runderbrucellose en het koninklijk besluit van 30 april 1999 betreffende de veterinairrechtelijke voorschriften voor het intracommunautair verkeer van runderen en varkens

ALBERT II, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet.

Gelet op de dierengezondheidswet van 24 maart 1987, inzonderheid op hoofdstuk III, gewijzigd bij de wetten van 28 maart 2003 en 27 december 2005;

Gelet op het koninklijk besluit van 6 december 1978 betreffende de bestrijding van de runderbrucellose gewijzigd door de koninklijke besluiten van 20 januari 1988, 27 januari 1989, 10 januari 1990, 9 januari 1991, 28 november 1991, 17 april 1992, 19 augustus 1992, 20 oktober 1992, 19 juli 1996, 10 september 1996 en 13 juli 2001;

Gelet op het koninklijk besluit van 30 april 1999 betreffende de veterinairrechtelijke voorschriften voor het intracommunautair verkeer van runderen en varkens;

Overwegende de verordening (EG) nr. 535/2002 van de Commissie van 21 maart 2002 tot wijziging van bijlage C bij richtlijn 64/432/EEG van de Raad en van beschikking 2000/330/EG;

Overwegende de beschikking 2003/467/EG van de Commissie van 23 juni 2003 houdende erkenning van bepaalde lidstaten en delen van lidstaten als officieel tuberculosevrij, officieel brucellosevrij en officieel vrij van enzoötische boviene leukose ten aanzien van de rundveebeslagen;

Overwegende de beschikking 2004/226/EG van de Commissie van 4 maart 2004 houdende erkenning van tests voor de opsporing van antilichamen tegen runderbrucellose in het kader van richtlijn 64/432/EEG van de Raad;

Gelet op het advies van de Inspecteur van Financiën, gegeven op 25 oktober 2005;

Gelet op het overleg tussen de Gewestregeringen en de Federale Overheid op 24 april 2006;

Gelet op het advies van het Wetenschappelijk Comité, ingesteld bij het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen, gegeven op 15 maart 2006;

Gelet op het advies nr. 41.306/3 van de Raad van State gegeven op 28 september 2006, met toepassing van artikel 84, § 1, eerste lid, 1°, van de gecoördineerde wetten op de Raad van State;

Op de voordracht van Onze Minister van Sociale Zaken en Volksgezondheid;

Hebben Wij besloten en besluiten Wij :

Artikel 1.In artikel 2 van het koninklijk besluit van 6 december 1978 betreffende de bestrijding van runderbrucellose, worden de punten 1 en 2 vervangen als volgt : « 1. Rund aangetast door brucellose : het rund bij hetwelk laboratoriumonderzoeken hebben uitgewezen hetzij : a. de aanwezigheid van brucella's;b. een door het Nationaal Referentielaboratorium uitgevoerde positieve ELISA. En, in het bijzonder geval van een haard of in besmette of verdacht besmette bedrijven, het rund dat klinische verschijnselen van brucellose vertoont. 2. Rund verdacht aangetast door brucellose : wordt beschouwd als verdacht aangetast het rund dat hetzij : a) verworpen heeft of symptomen vertoont die een verwerping voorafgaan of volgen;b) bij een ringtest op een melkmonster een positieve reactie vertoont;c) behoort tot een veebeslag waar de ringtest op een mengmelkmonster een positieve reactie vertoont; d) bij een serologisch onderzoek een agglutinatietiter gelijk aan of hoger dan 30 I.E. per milliliter heeft. ».

Art. 2.Bijlage I van hetzelfde besluit wordt vervangen door de bijlage 1 van dit besluit.

Art. 3.Bijlage II van hetzelfde besluit wordt vervangen door de bijlage 2 van dit besluit.

Art. 4.Artikel 7.2.b) van het koninklijk besluit van 30 april 1999 betreffende de veterinairrechtelijke voorschriften voor het intracommunautair verkeer van runderen en varkens wordt vervangen als volgt : « b) zij moeten afkomstig zijn van een officieel brucellosevrij rundveebedrijf en wanneer het gaat om niet-gecastreerde dieren ouder dan twaalf maanden, een brucellatiter hebben vertoond van minder dan 30 internationale agglutinatie-eenheden per milliliter bij een serumagglutinatietest of minder dan 20 internationale Complementbindingsreactie-eenheden per milliliter bij een complementbindingsreactieeenheden of een negatieve reactie hebben op een gebufferde brucella-antigeentest of een ELISA, die in de laatste 30 dagen voordat zij het beslag van oorsprong hebben verlaten, is uitgevoerd en dit overeenkomstig de voorschriften van bijlage 2.

De hierboven vermelde testen zijn niet vereist wanneer de dieren afkomstig zijn uit een gedeelte van het grondgebied van het Rijk dat als officieel brucellosevrij erkend is of dat deel uitmaakt van een erkend netwerk van toezicht.

Wanneer een van de bovenvermelde testen wordt gebruikt voor certificering, moet die test worden vermeld in de kolom "test" van de tabellen in afdeling A, punt 3, tweede streepje, en in punt 5, van afdeling A van bijlage F, model 1 in toepassing van richtlijn 64/432/EEG. ».

Art. 5.Dit besluit treedt in werking de dag waarop het in het Belgisch Staatsblad wordt bekendgemaakt.

Art. 6.Onze minister bevoegd voor volksgezondheid is belast met de uitvoering van dit besluit.

Gegeven te Brussel, 21 december 2006.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Sociale Zaken en Volksgezondheid, R. DEMOTTE

Bijlage I Gezondheidsstatuut van de beslagen A. Onder beslag met gezondheidsstatuut B1 wordt verstaan : een beslag waarvan de klinische antecedenten en de toestand op het gebied van de inenting en op serologisch gebied onbekend zijn.

B. Onder beslag met gezondheidsstatuut B2 wordt verstaan : een beslag waarvan de klinische antecedenten, de toestand op het gebied van de inenting en op serologisch gebied bekend zijn en waarbij routinecontroletests worden verricht overeenkomstig bijlage 1 C, nodig om dergelijk beslag een B3 (brucellosevrij) of B4 (officieel brucellosevrij) gezondheidsstatuut te geven.

C. Onder beslag met gezondheidsstatuut B3 of brucellosevrij wordt verstaan : een beslag : a) waartoe geen mannelijk rund behoort dat tegen brucellose is ingeënt;b) waar alle of een deel van de vrouwelijke runderen zijn ingeënt : - op een leeftijd van ten hoogste zes maanden met de levende entstof Buck 19 of met een andere door de Europese Gemeenschap goedgekeurde entstof; - op een leeftijd van ten hoogste vijftien maanden, met de gedode geadjuveerde entstof 45/20 die officieel gecontroleerd en erkend is; c) waar alle runderen voldoen aan de in punt D, b) en c), vermelde voorwaarden, met dien verstande dat de runderen die jonger zijn dan dertig maanden en die met de levende entstof Buck 19 zijn ingeënt, bij een bloedserumagglutinatie een brucellosetiter van 30 I.E. per milliliter of meer, maar minder dan 80 I.E. per milliliter vertonen, mits zij bij de complementbindingsreactie : - een titer van minder dan 30 EG-eenheden vertonen, indien het vrouwelijke runderen betreft die minder dan twaalf maanden geleden zijn ingeënt; - in alle andere gevallen een titer van minder dan 20 EG-eenheden vertonen.

De serumagglutinatietests bedoeld onder punt D, c), i), mogen vervangen worden door microagglutinatietests of door Elisatesten uitgevoerd overeenkomstig bijlage II; d) waaraan geen enkel rund is toegevoegd zonder een attest van een dierenarts, waaruit blijkt dat : - het voldoet aan de in punt D, d), gestelde voorwaarden of het afkomstig is van een beslag met gezondheidsstatuut B3 of brucellosevrij en in dit geval, indien twaalf maanden of ouder, binnen dertig dagen voor de opneming in het beslag, bij een bloedserumagglutinatie, verricht overeenkomstig bijlage 2, een brucellosetiter van minder dan 30 I.E. per milliliter en een negatieve complementbindingsreactie heeft vertoond.

Betreft het echter een ingeënt rund jonger dan dertig maanden, dan mag de bloedserumagglutinatie een brucellosetiter van 30 I.E. per milliliter of meer, maar minder dan 80 I.E. per milliliter vertonen, mits het bij de complementbindingsreactie : - een titer van minder dan 30 EG-eenheden vertoont, indien het een vrouwelijk rund betreft dat minder dan twaalf maanden geleden is ingeënt; - na de twaalfde maand volgend op de inenting een titer van minder dan 20 EG-eenheden vertoont.

D. Onder beslag met gezondheidsstatuut B4 of officieel brucellosevrij wordt verstaan, een beslag : a) waartoe geen runderen behoren die tegen brucellose zijn ingeënt, tenzij het vrouwelijke runderen betreft die minstens drie jaar geleden zijn ingeënt;b) waar alle runderen sedert ten minste zes maanden geen klinische brucelloseverschijnselen vertonen; c) waar alle runderen die vierentwintig maanden of ouder zijn : i) - bij 2 verrichte bloedserumagglutinaties onder officieel toezicht met een tussenpoos van tenminste drie maanden en ten hoogste twaalf maanden volgens de bepalingen in de bijlage II, een brucellosetiter hebben vertoond van minder dan 30 I.E. per milliliter; - de eerste bloedserumagglutinatie kan worden vervangen door drie ringtests. Deze worden uitgevoerd met een tussenpoos van drie maanden, mits de tweede bloedserumagglutinatie ten minste zes weken na de derde ringtest wordt verricht; - deze serumagglutinatietests mogen vervangen worden door 2 micro-agglutinatietests of door 2 Elisa's uitgevoerd overeenkomstig de bijlage II en uitgevoerd met een tussenpoos van ten minste drie en ten hoogste twaalf maanden; ii) - jaarlijks worden gecontroleerd door middel van drie ringtests op melkmonster, verricht met een tussenpoos van ten minste drie maanden of twee ringtests op melkmonster, verricht met een tussenpoos van ten minste drie maanden en één serologische test (serumagglutinatietest, gebufferde brucella-antigeentest, plasma-agglutinatietest, plasmamelkringtest, micro-agglutinatietest of individuele Elisatest met bloedmonster), verricht ten minste zes weken na de tweede ringtest op melkmonster, ten einde de afwezigheid van brucellose vast te stellen.

Indien geen ringtests op melkmonster worden uitgevoerd, dienen elk jaar twee serologische tests (serumagglutinatietest, gebufferde brucella-antigeentest, plasma-agglutinatietest, plasmamelkringtest, micro-agglutinatietest of individuele Elisa-test op bloedmonster) te worden uitgevoerd met een tussenpoos van ten minste drie en ten hoogste zes maanden.

Wanneer in het ganse Rijk of een gebied van het Rijk waar voor alle rundveebeslagen officiële maatregelen inzake brucellosebestrijding gelden, het percentage besmette rundveebeslagen niet hoger ligt dan 1, behoeven jaarlijks slechts twee ringtests te worden verricht met een tussenpoos van ten minste drie maanden of één serologische test (serumagglutinatietest, gebufferde brucellaantigeentest, plasma-agglutinatietest, plasmamelkringgtest, micro-agglutinatietest of individuele Elisa-test met bloedmonster); - Wanneer ringtests worden verricht bij de controle van tankmelk wordt het aantal ringtests, bedoeld in de vorige alinea's, verdubbeld en worden de aldaar bedoelde tussenpozen gehalveerd; ii) van de eisen met betrekking tot de sub ii) bedoelde jaarlijkse controle op afwezigheid van brucellose kan worden afgezien indien sinds ten minste vier jaar minstens 99,80 % van de rundveebeslagen officieel als brucellosevrij erkend zijn.

In dat geval kan de tussenpoos voor de controle door middel van één van de onder sub ii) genoemde serologische proeven tot drie jaar worden verlengd.

De selectie van de beslagen voor serologisch onderzoek gebeurt door het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen.

Na regelmatige evaluatie van de epidemiologische situatie organiseert het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen jaarlijks het serologisch onderzoek van importrunderen afkomstig uit derde landen of lidstaten die niet officieel brucellosevrij zijn.

Dit onderzoek wordt uitgevoerd door middel van een micro-agglutinatietest en een Elisa gedurende drie opeenvolgende jaren. d) waaraan geen enkel rund is toegevoegd zonder een attest van een aangenomen dierenarts, waaruit blijkt dat het afkomstig is van een beslag met gezondheidsstatuut B4 of officieel brucellosevrij en indien het twaalf maand of ouder is, dat bij een bloedserumagglutinatie die binnen de dertig dagen voor de toevoeging aan het beslag werd verricht overeenkomstig het bepaalde in bijlage II, een brucellosetiter van minder dan 30 I.E. per milliliter heeft vertoond; i) de bloedserumagglutinatie behoort echter niet te worden geëist, wanneer het percentage haarden sinds ten minste twee jaar niet hoger ligt dan 0,2 en wanneer uit een attest van een aangenomen dierenarts blijkt dat het desbetreffende rund : 1.behoorlijk is geïdentificeerd; 2. afkomstig is uit een beslag met gezondheidsstatuut B4 of officieel brucellosevrij;3. bij zijn vervoer niet in aanraking is gekomen met runderen die niet afkomstig zijn uit beslagen met gezondheidsstatuut B4 of officieel brucellosevrij; ii) het sub i) bedoelde attest hoeft niet te worden geëist wanneer sedert ten minste vier jaar : - tenminste 99,80 % van de beslagen het gezondheidsstatuut B4 hebben of officieel brucellosevrij zijn, - en op de beslagen die niet het gezondheidsstatuut B4 hebben of niet als officieel brucellosevrij erkend zijn, officieel toezicht bestaat, waarbij het overbrengen van runderen buiten deze beslagen verboden is behalve wanneer zij naar een slachthuis worden gebracht vergezeld van een geleidebrief afgeleverd door de inspecteur-dierenarts.

Gezien om te worden gevoegd bij Ons Besluit van 21 december 2006 tot wijziging van het koninklijk besluit van 6 december 1978 betreffende de bestrijding van de runderbrucellose en het koninklijk besluit van 30 april 1999 betreffende de veterinairrechtelijke voorschriften voor het intracommunautair verkeer van runderen en varkens.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Sociale Zaken en Volksgezondheid, R. DEMOTTE

Bijlage II Biologische proeven 1. IDENTIFICATIE VAN HET AGENS Wanneer aan de hand van een gemodificeerde zuurvaste kleurmethode of een immuunkleuring de aanwezigheid van morfologisch op brucella gelijkende micro-organismen kan worden aangetoond in abortusmateriaal, vaginale secreties of melk, geldt dat als afdoende bewijs voor een besmetting met brucella, vooral wanneer deze bevinding wordt ondersteund door de resultaten van serologische tests. Na isolatie van de micro-organismen moeten de soort en de biovar worden geïdentificeerd door middel van bacteriofaaglysistests en/of oxidatieve metabolismetests, dan wel cultuur, biochemische en serologische eigenschappen van het isolaat.

De gebruikte technieken en media, de standaardisering ervan en de interpretatie van de resultaten moeten in overeenstemming zijn met die van het "Manual of Standards for Diagnostic tests and Vaccines" (Handboek voor normen inzake diagnostische tests en vaccins) van het OIE, vierde editie, 2000, hoofdstuk 2.3.1 (runderbrucellose), hoofdstuk 2.4.2 (schapen- en geitenbrucellose) en hoofdstuk 2.6.2 (varkensbrucellose). 2. IMMUNOLOGISCHE TESTS 2.1. Standaarden 2.1.1. Voor de bereiding van alle antigenen voor gebruik in de Bengaals-roodtest (BRT), de serumagglutinatietest (SAT), de complementbindingsreactie (CBR) en de Abortus Bang Ringtest (ABR) moet gebruik worden gemaakt van de Weybridgestam nr. 99 of de USDA-stam 1119-3 van Brucella-abortus biovar 1. 2.1.2. Het standaardreferentieserum voor de bovengenoemde tests is het internationaal referentiestandaardserum van het OIE (OIEISS) dat vroeger bekend stond onder de naam WHO tweede internationaal anti-Brucella-abortusserum (ISAbS). 2.1.3. De standaardreferentiesera voor Elisa's zijn : - het internationale standaard referentieserum van het OIE (OIEISS), - het zwak positieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISAWPSS), - het sterk positieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISASPSS), - het negatieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISANSS). 2.1.4. De bovengenoemde standaardsera kunnen worden betrokken bij het Veterinary Laboratories Agency (VLA) in Weybridge, Verenigd Koninkrijk. 2.1.5. Het OIEISS, het OIEELISAWPSS, het OIEELISASPSS en het OIEELISANSS zijn de internationale primaire standaarden waarvan een secundaire nationale referentiestandaard ("werkstandaard") moet worden afgeleid voor elke test die wordt gebruikt. 2.2. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) of andere bindingstests voor de opsporing van runderbrucellose in serum of melk. 2.2.1. Materiaal en reagentia De gebruikte techniek en de interpretatie van de resultaten moeten zijn gevalideerd overeenkomstig de principes die zijn vastgesteld in hoofdstuk 1.1.3 van het "Manual of Standards for Diagnostic tests and Vaccines" (Handboek voor normen inzake diagnostische tests en vaccins) van het OIE, vierde editie, 2000, en moeten ten minste laboratoriumonderzoek en diagnostisch onderzoek omvatten. 2.2.2. Standaardisatie van de test 2.2.2.1. Standaardisatie van de testprocedure voor individuele serummonsters : a) een 1/150 voorverdunning (1) van het OIEISS of een 1/2 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) moet positief reageren;b) een 1/600 voorverdunning van het OIENS of een 1/8 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/64 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) moet negatief reageren;c) het OIEELISANSS moet steeds negatief reageren. 2.2.2.2. Standaardisatie van de testprocedure voor mengmonsters van sera : a) een 1/150 voorverdunning van het OIEISS of een 1/2 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) en vervolgens opnieuw verdund in negatieve sera met een factor die overeenkomt met het aantal monsters in het mengmonster, moet positief reageren;b) het OIEELISANSS moet steeds negatief reageren;c) de test moet toereikend zijn voor het aantonen van een infectie bij een enkel dier van een groep dieren waarvan de serummonsters tot een mengmonster zijn samengevoegd. 2.2.2.3. Standaardisatie van de testprocedure voor mengmonsters van melk of wei : a) een 1/1 000 voorverdunning van het OIEISS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/125 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) en vervolgens opnieuw verdund in een verhouding 1/10 in negatieve melk, moet positief reageren;b) het OIEELISANSS verdund in een verhouding 1/10 in negatieve melk, moet steeds negatief reageren;c) de test moet toereikend zijn voor het aantonen van een infectie bij een enkel dier van een groep dieren waarvan de melk of weimonsters tot een mengmonster zijn samengevoegd. 2.2.3. Voorschriften voor het gebruik van de ELISA voor de diagnose van runderbrucellose 2.2.3.1. Bij toepassing van bovengenoemde kalibratievoorschriften voor de ELISA met gebruikmaking van serummonsters en met inachtneming van de epizoötiologische situatie waarin de test wordt toegepast, moet de diagnostische gevoeligheid van de ELISA ten minste gelijk zijn aan die van de BRT, de CBR of de SAT. 2.2.3.2. Bij toepassing van bovengenoemde kalibratievoorschriften voor de ELISA met gebruikmaking van mengmonsters van melk en met inachtneming van niet alleen de epizoötiologische situatie maar ook de gemiddelde en de te verwachten extreme veehouderijsystemen, moet de diagnostische gevoeligheid van de ELISA ten minste gelijk zijn aan die van de ABR. 2.2.3.3. Wanneer een ELISA wordt gebruikt voor certificeringsdoeleinden overeenkomstig Richtlijn 64/432/EEG, artikel 6, lid 1 of voor het bepalen en handhaven van de gezondheidsstatus van een beslag overeenkomstig Richtlijn 64/432/EEG, bijlage A II, punt 10, moet het vormen van mengmonsters van serum zo worden uitgevoerd dat de testresultaten onomstotelijk kunnen worden gerelateerd aan elk individueel dier in het mengmonster. Tests ter bevestiging moeten worden uitgevoerd op serummonsters van individuele dieren. 2.2.3.4. De ELISA kan worden gebruikt op een verzamelmelkmonster genomen op een bedrijf met ten minste 30 % lacterende melkkoeien.

Wanneer deze methode wordt toegepast, moeten maatregelen worden genomen om erop toe te zien dat de voor onderzoek genomen monsters onomstotelijk kunnen worden gerelateerd aan elk individueel dier waarvan melk is verkregen. Tests ter bevestiging moeten worden uitgevoerd'op serummonsters van individuele dieren. 2.3. Complementbindingsreactie (CBR) 2.3.1. Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een fysiologische zoutoplossing (0,85 % NaCI (m/v) met 0,5 % (v/v) fenol of in een veronalbufferoplossing. De antigenen mogen geconcentreerd worden aangeleverd, op voorwaarde dat de te gebruiken verdunningsfactor is aangegeven op het etiket van de fles. Het antigeen moet worden bewaard bij 4 °C en mag niet worden bevroren. 2.3.2. De sera moeten als volgt worden geïnactiveerd : - runderserum : 30-50 minuten bij 56-60 °C - varkensserum : 30-50 minuten bij 60 °C 2.3.3. Voor het verkrijgen van een juiste reactie dient een complementdosis te worden gebruikt die groter is dan de voor een volledige hemolyse vereiste minimumdosis. 2.3.4. Bij de uitvoering van de complementbindingsreactie moeten telkens de volgende controles worden verricht : a) controle van het anticomplementaire effect van het serum;b) controle van het antigeen;c) controle van de gesensibiliseerde rode bloedlichaampjes;d) controle van het complement;e) controle van de gevoeligheid met gebruikmaking van een positief controleserum vanaf het begin van de reactie;f) controle van de specificiteit van de reactie met gebruikmaking van een negatief controleserum. 2.3.5. Berekening van de resultaten : Het OIEISS bevat 1 000 internationale complementbindingsreactie-eenheden (ICFTU) per ml. Indien het OIEISS wordt getest met een bepaalde methode, wordt het resultaat weergegeven als een titer (TOIEISS). Het als titer (TTESTSERUM) weergeven testresultaat voor het testserum moet worden uitgedrukt in ICFTU per ml. Voor de omrekening van een titer in ICFTU, wordt de factor (F) die nodig is voor de omrekening van de titer van een onbekend testserum (TTESTSERUM) dat met die methode is getest naar de ICFTU, verkregen aan de hand van de formule : F = 1 000 X 1/TOIESS en de hoeveelheid ICFTU per ml testserum aan de hand van de formule ICFTUTESTSERUM = F x TTESTSERUM 2.3.6. Interpretatie van de resultaten.

Serum met 20 of meer ICFTU per ml wordt als positief aangemerkt. 2.4. Abortus Bang Ringtest (ABR) 2.4.1. Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een fysiologische zoutoplossing (0,85 % NaCI (m/v) met 0,5 % (v/v) fenol, gekleurd met hematoxyline. Het antigeen moet worden opgeslagen bij 4 °C en mag niet worden bevroren. 2.4.2. De gevoeligheid van het antigeen moet worden gestandaardiseerd tegenover het OIEISS op zodanige wijze dat een 1/500 verdunning van het OIEISS in negatieve melk positief reageert terwijl een 1/1 000 verdunning negatief reageert. 2.4.3. De ringtest moet worden uitgevoerd op monsters die zijn genomen uit de inhoud van elke melkbus of uit de inhoud van elke melktank van het bedrijf. 2.4.4. De melkmonsters mogen niet bevroren noch verhit zijn en mogen evenmin heftig zijn geschud. 2.4.5. De reactie moet worden uitgevoerd volgens een van de volgende methoden : - op een melkkolom met een hoogte van ten minste 25 mm en op een hoeveelheid melk van 1 ml waaraan 0,03 ml, dan wel 0,05 ml van een gestandaardiseerd gekleurd antigeen is toegevoegd; - op een melkkolom met een hoogte van ten minste 25 mm en op een hoeveelheid melk van 2 ml waaraan 0,05 ml van een gestandaardiseerd gekleurd antigeen is toegevoegd; - op een hoeveelheid melk van 8 ml waaraan 0,08 ml van een gestandaardiseerd gekleurd antigeen is toegevoegd. 2.4.6. Het mengsel van melk en antigeen moet gedurende 60 minuten bij 37 °C worden geïncubeerd samen met de positieve en de negatieve werkstandaarden. Een daaropvolgende incubatie bij 4 °C gedurende 16 à 24 uur verhoogt de gevoeligheid van de test. 2.4.7. Interpretatie van de resultaten : a) negatieve reactie : gekleurde melk, kleurloze room;b) positieve reactie : - melk en room op gelijke wijze gekleurd, of - kleurloze melk en gekleurde room. 2.5. Bengaals-roodtest (BRT) 2.5.1. Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een gebufferde brucella-antigeen verdunningsvloeistof met een pH van 3,65 + 0,05, gekleurd met Bengaalsrood. Het antigeen wordt gebruiksklaar aangeleverd, moet worden opgeslagen bij 4 °C en mag niet worden bevroren. 2.5.2. Het antigeen wordt bereid zonder rekening te houden met de celconcentratie maar de gevoeligheid ervan moet worden gekalibreerd ten opzichte van het OIEISS op zodanige wijze, dat een verdunning van 1/45 van het OIEISS positief reageert en een verdunning van 1/55 negatief reageert. 2.5.3. De BRT wordt uitgevoerd op de volgende manier : a) een druppel serum (20-30 µl) wordt gemengd met eenzelfde volume antigeen op een wit plaatje of op een emailplaatje zodat een diameter van ongeveer 2 cm wordt verkregen.Het mengsel wordt zachtjes geschud gedurende 4 minuten bij omgevingstemperatuur en wordt vervolgens bij goede verlichting onderzocht op agglutinatie; b) een geautomatiseerde methode mag worden gebruikt maar die moet ten minste even gevoelig en nauwkeurig zijn als de manuele methode. 2.5.4. Interpretatie van de resultaten Elke zichtbare reactie wordt als positief beschouwd tenzij er sprake is van overmatige droging aan de randen.

Positieve en negatieve werkstandaarden moeten in elke testserie worden opgenomen. 2.6. Serumagglutinatietest (SAT) 2.6.1. Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een fysiologische zoutoplossing (0,85 % NaCI (m/v) met 0,5 % (v/v) fenol.

Formaldehyde mag niet worden gebruikt.

De antigenen mogen geconcentreerd worden geleverd op voorwaarde dat op het etiket van de fles de vereiste verdunningfactor is aangegeven.

Aan de antigeensuspensie mag EDTA worden toegevoegd tot een concentratie van 5 mM in de te testen eindverdunning teneinde het aantal valspositieve resultaten met de serumagglutinatie te verminderen. Vervolgens moet de pH van de antigeensuspensie worden bijgesteld tot een pH van 7,2. 2.6.2. Het OIEISS bevat 1 000 internationale agglutinatie-eenheden. 2.6.3. Het antigeen wordt bereid zonder rekening te houden met de celconcentratie maar de gevoeligheid ervan moet worden gekalibreerd ten opzichte van het OIEISS op zodanige wijze dat : hetzij een 50 %-agglutinatie optreedt bij een eindverdunning van het OIEISS tussen 1/600 en 1/1 000 hetzij een 75 %-agglutinatie bij een eindverdunning van het OIEISS tussen 1/500 en 1/750.

Het verdient aanbeveling de reactiviteit van nieuwe batches antigeen te vergelijken met reeds vroeger gestandaardiseerde batches antigeen met gebruikmaking van een set van welomschreven sera. 2.6.4. De test wordt uitgevoerd in buisjes of in microtiterplaten. Het mengsel van antigeen en serumverdunningen moet worden geïncubeerd bij 37 °C gedurende 16 à 24 uur.

Van elk serum moeten ten minste drie verdunningen worden aangelegd.

Serum moet zo worden verdund dat de minimale positieve waarde (30 IE/ml) in het middelste buisje (of het middelste putje van de verdunningsreeks in een microtiterplaat wordt afgelezen. 2.6.5. Interpretatie van de resultaten Het testresultaat van de serumagglutinatie van een serum wordt uitgedrukt in internationale eenheden (IE) per ml.

Een serum dat ten minste 30 IE per ml bevat, wordt als positief beschouwd. 3. AANVULLENDE TESTS 3.1. Intradermale test op brucellose (brucellinetest) 3.1.1. Voorschiften voor het gebruik van de brucellinetest a) De brucellinetest mag niet worden gebruikt in het kader van de certificering voor het intracommunautaire handelsverkeer.b) De brucellinetest is één van de meest specifieke tests voor de opsporing van de brucellose bij niet-gevaccineerde dieren maar de diagnose mag niet worden gesteld op basis van positieve intradermale reacties alleen.c) Runderen die negatief hebben gereageerd bij één van de in deze bijlage omschreven serologische tests en die positief reageren bij de brucellinetest worden als besmet beschouwd.d) Runderen die positief hebben gereageerd bij één van de in deze bijlage omschreven serologische tests, kunnen aan een brucellinetest worden onderworpen om de interpretatie van de resultaten van de serologische test te bevestigen, vooral wanneer bij brucellosevrije of officieel brucellosevrije beslagen een kruisreactie met antilichamen tegen andere bacteriën niet kan worden uitgesloten. 3.1.2. De test moet worden uitgevoerd met gebruikmaking van een gestandaardiseerd en gedefinieerd brucellinepreparaat dat geen glad lipopolysaccharide (LPS) antigeen bevat, aangezien dit een niet-specifieke ontstekingsreactie kan veroorzaken of het resultaat van latere serologische tests kan beïnvloeden.

Een voorbeeld van een dergelijk preparaat is het brucelline van het INRA, bereid van een nietgladde stam van Brucella melitensis. De productievoorschriften zijn beschreven in deel B2 van hoofdstuk 2.4.2 van het "Manual of Standards for Diagnostic tests en Vaccines" (Handboek inzake normen voor diagnostische tests en vaccins) van het OIE, vierde editie, 2000. 3.1.3. Testprocedure 3.1.3.1. 0,1 ml brucelline wordt intradermaal geïnjecteerd in de staartplooi, de flankhuid of de zijkant van de nek. 3.1.3.2. De test wordt afgelezen na 48 - 72 uur. 3.1.3.3. De dikte van de huid op de plaats van injectie wordt gemeten met een krompasser of schuifmaat vóór de injectie en bij aflezing. 3.1.3.4. Interpretatie van de resultaten : Sterke reacties worden gemakkelijk herkend aan de hand van de lokale zwelling en verharding. Een huidverdikking van 1,5 à 2 mm moet worden beschouwd als een positieve reactie op de brucellinetest. 3.2. Competitie-Elisa (cELISA) 3.2.1. Voorwaarden voor het gebruik van de cELISA a) de cELISA mag niet worden gebruikt in het kader van de certificering voor het intracommunautaire handelsverkeer.b) De cELISA kan als hulpmiddel worden gebruikt bij de interpretatie van de resultaten van de overige serologische testen aangezien is aangetoond dat de cELISA een hogere specificiteit bezit dan bijvoorbeeld de indirecte ELISA. 3.2.2. Testprocedure De test moet worden uitgevoerd zoals vastgesteld in het "Manual of Standards for Diagnostic tests en Vaccines" (Handboek inzake normen voor diagnostische tests en vaccins) van het OIE, vierde editie, 2000, hoofdstuk 2.3.1 (2)(a). 4. NATIONALE REFERENTIELABORATORIA 4.1. Taken en bevoegdheden De nationale referentielaboratoria zijn verantwoordelijk voor : a) de goedkeuring van de resultaten van de validatiestudies waaruit moet blijken dat de in de lidstaat gebruikte testmethode betrouwbaar is;b) de bepaling van het maximumaantal monsters dat mag worden samengevoegd in de gebruikte ELISA-kits; c) de kalibratie van de nationale secundaire referentiestandaardsera (werkstandaarden) ten opzichte van het internationale primaire standaardserum als bedoeld in lid 2.1; d) de kwaliteitscontroles van alle antigenen en alle batches ELISA-kits die in de lidstaat worden gebruikt;e) de samenwerking met het netwerk van nationale referentielaboratoria voor brucellose van de Europese Gemeenschap;f) het verzamelen en systematisch typeren van de stammen, alsook hun centralisatie en archivering;g) de bevestiging van positieve serologische en bacteriologische tests;h) organisatie en definitie van ringtests;i) de opvolging van de epidemiologische situatie in andere landen; j) de taken in verband met technische coordinatie 4.2. Nationaal referentielaboratorium Centrum voor onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie (CERVA/CODA) Groeselenberg 99 B - 1180 Brussel Gezien om te worden gevoegd bij Ons Besluit van 21 december 2006 tot wijziging van het koninklijk besluit van 6 december 1978 betreffende de bestrijding van de runderbrucellose en het koninklijk besluit van 30 april 1999 betreffende de veterinairrechtelijke voorschriften voor het intracommunautair verkeer van runderen en varkens.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Sociale Zaken en Volksgezondheid, R. DEMOTTE _______ Nota's (1) In deze bijlage worden de voor het aanmaken van vloeibare reagentia aan te leggen verdunningen uitgedrukt als b.v. 1/150, wat neerkomt op een verdunning van 1 op 150.