16 AVRIL 1998. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 26 novembre 1981 relatif aux méthodes d'analyse de référence nécessaires au contrôle de la composition des produits cosmétiques

ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et à venir, Salut.

Vu la loi du 24 janvier 1977 relative à la protection de la santé des consommateurs en ce qui concerne les denrées alimentaires et les autres produits, notamment l' article 12, modifié par la loi du 22 mars 1989;

Vu l'arrêté royal du 26 novembre 1981 relatif aux méthodes d'analyse de référence nécessaires au contrôle de la composition des produits cosmétiques, modifié par les arrêtés royaux des 19 février 1985, 5 novembre 1985, 30 juin 1986, 11 septembre 1987, 5 décembre 1990, 16 septembre 1991 et 1er avril 1996;

Considérant la sixième directive 95/32/CE de la Commission du 7 juillet 1995 et la septième directive 96/45/CE de la Commission du 2 juillet 1996 relatives aux méthodes d'analyse nécessaires au contrôle de la composition des produits cosmétiques;

Vu les lois sur le Conseil d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973, notamment l'article 3, § 1er, modifié par les lois des 9 août 1980, 16 juin 1989 et 4 juillet 1989;

Vu l'urgence, justifiée par la mise en demeure de la Commission en date du 29 décembre 1997;

Sur la proposition de Notre Ministre de la Santé publique et des Pensions, Nous avons arrêté et arrêtons :

Article 1er.Les méthodes d'analyses, reprises à l'annexe de l'arrêté royal du 26 novembre 1981 relatif aux méthodes d'analyse de référence nécessaires au contrôle de la composition des produits cosmétiques, sont complétées par les dispositions XXXV à XXXVII, reprises à l'annexe du présent arrêté.

Art. 2.Notre Ministre de la Santé publique et des Pensions est chargé de l'exécution du présent arrêté.

Donné à Châteauneuf-de-Grasse, le 16 avril 1998.

ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique et des Pensions, M. COLLA

ANNEXE XXXV. Identification et détermination de l'acide benzoïque, de l'acide 4-hydroxybenzoïque, de l'acide sorbique, de l'acide salicylique et de l'acide propionique dans les produits cosmétiques 1. Objet et champ d'application Cette méthode est applicable à l'identification et au dosage de l'acide benzoïque, de l'acide 4-hydroxybenzoïque, de l'acide sorbique et de l'acide salicylique dans les produits cosmétiques.Des modes opératoires différents concernent l'identification de ces conservateurs, le dosage de l'acide propionique et celui de l'acide 4-hydroxybenzoïque, de l'acide salicylique, de l'acide sorbique et de l'acide benzoïque. 2. Définition Les teneurs en acide benzoïque, en acide 4-hydroxybenzoïque, en acide sorbique et en acide salicylique déterminées par cette méthode sont exprimées en pourcentage de masse des acides libres. A. Identification 1. Principe Après extraction acide/base des conservateurs, l'extrait obtenu est analysé par chromatographie sur couche mince avec dérivation sur plaque.En fonction des résultats, l'identification est confirmée par chromatographie en phase liquide à haute performance ou, dans le cas de l'acide propionique, par chromatographie en phase gazeuse. 2. Réactifs 2.1. Généralités Tous les réactifs doivent être de qualité analytique. Il convient d'employer de l'eau distillée ou une eau d'une pureté au moins équivalente. 2.2. Acétone 2.3. Diéthyle oxyde 2.4. Acétonitrile 2.5. Toluène 2.6. n-Hexane 2.7. Parrafine liquide 2.8. Acide chlorhydrique, 4 M 2.9. Hydroxyde de potassium, 4 M en solution aqueuse 2.10. Chlorure de calcium CaCl2.2H20 2.11. Carbonate de lithium Li2CO3 2.12. 2-Bromo-2'-acétonaphtone 2.13. Acide 4-hydroxybenzoïque 2.14. Acide salicylique 2.15. Acide benzoïque 2.16. Acide sorbique 2.17. Acide propionique 2.18. Solutions témoins Préparer une solution à 0,1 % (m/v) (100 mg/100 ml) pour chacun des cinq conservateurs (2.13 à 2.17) dans le diéthyle oxyde (2.3). 2.19. Réactif de dérivation Solution à 0,5 % (m/v) de 2-bromo-2'-acétonaphtone (2.12) dans de l'acétonitrile (2.4) (50 mg/10 ml). Il convient de renouveler cette solution chaque semaine et de la conserver au réfrigérateur. 2.20. Catalyseur en solution Solution aqueuse à 0,3 % (m/v) de carbonate de lithium (300 mg/100 ml). Cette solution doit être fraîchement préparée. 2.21. Solvant d'élution Toluène (2.5)/Acétone (2.2) (20:0,5; (v/v)) 2.22. Paraffine liquide (2.7)/n-hexane (2.6) (1:2; (v/v)) 3. Appareillage Equipement normal de laboratoire 3.1. Bain-marie à 60 °C 3.2. Cuve de développement 3.3. Source de lumière ultra-violette, 254 et 366 nm 3.4. Plaques pour CCM type Kieselgel 60, sans indicateur de fluorescence, 20 x 20 cm, épaisseur de la couche 0,25 mm avec zone de concentration de 2,5 x 20 cm (Merck 11845 ou équivalent) 3.5. Microseringue 10 |gml 3.6. Microseringue 25 |gml 3.7. Etuve à 105 °C 3.8. Tubes de verre de 50 ml avec bouchon à vis 3.9. Papier filtre, diamètre 90 mm, Schleicher et Schüll, Weissband no 5892 ou équivalent 3.10. Papier indicateur universel de pH, pH 1-11 3.11. Flacons à échantillon en verre, de 5 ml 3.12. Evaporateur rotatif (Rotovapor ou équivalent) 3.13. Plaque chauffante 4. Mode opératoire 4.1. Préparation de l'échantillon Peser environ 1 g d'échantillon dans un tube de verre de 50 ml à bouchon à vis (3.8). Ajouter quatre gouttes d'acide chlorhydrique 4 M (2.8) et 40 ml d'acétone (2.2). Pour les produits fortement basiques tels que les savons de toilette, il convient d'ajouter 20 gouttes d'acide chlorhydrique 4 M (2.8). Vérifier que le pH est d'environ 2 à l'aide du papier indicateur (3.10). Fermer le tube et agiter vigoureusement pendant une minute.

Le cas échéant, faciliter l'extraction des conservateurs dans la phase acétone en chauffant doucement le mélange à 60 °C afin de faire fondre la phase lipidique.

Laisser refroidir la solution à température ambiante et filtrer sur papier filtre (3.9) dans une fiole conique.

Transférer 20 ml du filtrat dans une fiole conique de 200 ml, ajouter 20 ml d'eau et mélanger. Ajuster le pH du mélange à environ 10 à l'aide d'hydroxyde de potassium 4 M (2.9). Mesurer le pH à l'aide du papier indicateur (3.10).

Ajouter 1 g de chlorure de calcium (2.10) et agiter vigoureusement.

Filtrer sur papier filtre (3.9) dans une ampoule à décanter de 250 ml contenant 75 ml de diéthyle oxyde (2.3) et agiter vigoureusement pendant une minute. Laisser décanter puis récupérer la couche aqueuse dans une fiole conique de 250 ml. Eliminer la couche d'éther. A l'aide du papier indicateur (3.10), ajuster le pH de la solution aqueuse à environ 2, au moyen d'acide chlorhydrique 4 M (2.8). Ajouter ensuite 10 ml de diéthyle oxyde (2.3), boucher la fiole et agiter vigoureusement pendant une minute. Laisser décanter puis transférer la couche d'éther dans un évaporateur rotatif (3.12). Eliminer la couche aqueuse.

Evaporer la couche d'éther presque à siccité et dissoudre le résidu dans 1 ml de diéthyle oxyde (2.3). Transférer la solution obtenue dans un flacon échantillon (3.11). 4.2. Chromatographie sur couche mince Pour chacun des échantillons et des solutions témoins à chromatographier, appliquer environ 3 |gml de solution de carbonate de lithium (2.20) à l'aide d'une seringue (3.5) à intervalles réguliers le long de la ligne de dépôt dans la zone de concentration d'une plaque de chromatographie sur couche mince (3.4) et sécher dans un courant d'air froid.

Placer la plaque pour CCM (3.4) sur une plaque chauffante (3.13) portée à 40 °C, afin de maintenir les taches aussi petites que possible. A l'aide d'une microseringue (3.5), appliquer 10 |gml de chaque solution témoin (3.17) et de la solution échantillon (4.1) sur la ligne de dépôt de la plaque, exactement sur les taches de solution de carbonate de lithium.

Appliquer enfin environ 15 |gml de réactif de dérivation (2.19) (solution d'alpha-bromo-2-acéto-naphtone) également exactement sur les taches de solutions témoins et d'échantillon ainsi que de solution Li2CO3.

Chauffer la plaque de chromatographie pendant 45 minutes dans une étuve à 80 °C (3.7).

Après refroidissement, développer la plaque dans une cuve (3.2) préablement saturée pendant 15 minutes (sans l'aide d'une garniture de papier filtre) avec un solvant d'élution toluène/acétone (2.21) jusqu'à ce que le front de solvant ait atteint une distance de 15 cm (80 minutes environ).

Sécher la plaque dans un courant d'air froid et examiner à la lumière ultra-violette (3.3) les taches obtenues. Afin de renforcer la fluorescence des taches les moins visibles, la plaque peut être plongée dans un bain de parrafine liquide/n-hexane (2.22). 5. Identification Calculer le Rf pour chaque tache. Comparer le Rf et le comportement aux rayons ultra-violets de l'échantillon et des solutions témoins.

Tirer une première conclusion sur l'identité des conservateurs présents. Procéder à la chromatographie en phase liquide à haute performance décrite à la partie B, ou à la chromatographie en phase gazeuse s'il y a présence d'acide propionique. Comparer les temps de rétention obtenus à ceux des solutions témoins.

Tenir compte des résultats obtenus en chromatographie sur couche mince et en chromatographie en phase liquide à haute performance ou en phase gazeuse, afin d'identifier les conservateurs présents dans l'échantillon.

B. Dosage de l'acide benzoïque, de l'acide 4-hydroxybenzoïque, de l'acide sorbique et de l'acide salicylique 1. Principe Après acidification, l'échantillon est extrait à l'aide d'un mélange d'eau et d'éthanol.Après filtration, des conservateurs sont dosés par chromatographie en phase liquide à haute performance. 2. Réactifs 2.1. Tous les réactifs doivent être de pureté analytique. Il convient d'utiliser de l'eau distillée ou une eau d'une pureté au moins équivalente. 2.2. Ethanol absolu 2.3. Acide 4-hydroxybenzoïque 2.4. Acide salicylique 2.5. Acide benzoïque 2.6. Acide sorbique 2.7. Acétate de sodium (CH3COONa.3H2O) 2.8. Acide acétique d 20 4 = 1,05 g/ml 2.9. Acétonitrile 2.10. Acide sulfurique 2 M 2.11. Hydroxyde de potassium aqueux 0,2 M 2.12. Acide 2-méthoxybenzoïque 2.13. Mélange eau/éthanol : mélanger 9 volumes d'éthanol (2.2) et un volume d'eau (2.1). 2.14. Solution d'étalon interne : préparer une solution contenant environ 1 g d'acide 2-méthoxybenzoïque (2.12) dans 500 ml de mélange eau/éthanol (2.13). 2.15. Phase mobile pour CLHP 2.15.1. Tampon d'acétate : ajouter 6,35 g d'acétate de sodium (2.7) et 20,0 ml d'acide acétique (2.8) à 1 litre d'eau et mélanger. 2.15.2. Préparer la phase mobile en mélangeant 9 volumes de tampon acétate (2.15.1) à 1 volume d'acétonitrile (2.9). 2.16. Solution mère de conservateurs Peser avec précision environ 0,05 g d'acide 4-hydroxybenzoïque (2.3), 0,2 g d'acide salicylique (2.4), 0,2 g d'acide benzoïque (2.5) et 0,05 g d'acide sorbique (2.6) dans une fiole jaugée de 50 ml et compléter au trait avec le mélange eau/éthanol (2.13). Conserver la solution au réfrigérateur. Cette solution est stable pendant une semaine. 2.17. Solutions standards de conservateurs Transférer respectivement 8,00, 4,00, 2,00, 1,00 et 0,50 ml de la solution mère dans des fioles jaugées de 20 ml. Ajouter dans chaque fiole 10,00 ml de solution d'étalon interne (2.14), 0,5 ml d'acide sulfurique 2 M (2.10) et compléter au trait avec le mélange eau/éthanol (2.13). Ces solutions doivent être fraîchement préparées. 3. Appareillage Equipement normal de laboratoire, plus : 3.1. Bain-marie à 60 °C 3.2. Chromatographe en phase liquide à haute performance équipé d'un détecteur UV à longeur d'onde variable et d'une boucle d'injection de 10 |gml 3.3. Colonne : acier inoxydable, longueur 12,5-25 cm, diamètre intérieur 4,6 mm, remplie avec du Nucleosil 5C18 ou équivalent 3.4. Papier filtre, diamètre 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband no 5892 ou équivalent 3.5. Tubes de verre de 50 ml avec bouchon à vis 3.6. Flacons échantillons en verre de 5 ml 3.7. Granulés régulateurs d'ébullition, carborundum, calibre 2-4 mm, ou équivalent. 4. Mode opératoire 4.1. Préparation de l'échantillon 4.1.1. Préparation de l'échantillon sans addition d'étalon interne Peser 1 g d'échantillon dans un tube de verre de 50 ml à bouchon à vis (3.5). Ajouter à l'aide d'une pipette 1,0 ml d'acide sulfurique 2 M (2.10) puis 40,0 ml de mélange eau/éthanol (2.13). Ajouter environ 1 g de granulés régulateurs d'ébullition (3.7), fermer le tube et agiter vigoureusement jusqu'à obtention d'une suspension homogène, en aucun cas pendant moins d'une minute. Afin de faciliter l'extraction des conservateurs dans la phase éthanol, placer le tube dans un bain-marie à 60 °C (3.1) pendant exactement 5 minutes.

Refroidir le tube immédiatement dans un courant d'eau froide puis conserver l'extrait à 5 °C pendant une heure.

Filtrer l'extrait sur papier filtre (3.4). Transférer environ 2 ml de l'extrait dans un flacon échantillon (3.6). Conserver l'extrait à 5 °C et procéder au dosage par chromatographie en phase liquide à haute performance dans les 24 h suivant la préparation de l'extrait. 4.1.2. Préparation de l'échantillon avec addition d'un étalon interne Peser à trois décimales près 1 g + 0,1 g (a gramme) d'échantillon dans un tube de verre de 50 ml à bouchon à vis (3.5). à l'aide d'une pipette, ajouter 1,0 ml d'acide sulfurique 2 M (2.10), puis 30,0 ml de mélange eau/éthanol (2.13). Ajouter environ 1 g de granulés régulateurs d'ébullition (3.7) et 10,00 ml de solution d'étalon interne (2.14). Fermer le tube et agiter vigoureusement jusqu'à obtention d'une suspension homogène, en aucun cas pendant moins d'une minute.

Afin de faciliter l'extraction des conservateurs dans la phase éthanol, laisser le tube pendant exactement 5 minutes dans un bain-marie à 60 °C (3.1).

Refroidir immédiatement le tube dans un courant d'eau froide et conserver à 5 °C pendant une heure.

Filtrer l'extrait sur papier filtre (3.4). Transférer 1 ou 2 ml de l'extrait filtré dans un flacon échantillon (3.6). Conserver le filtrat à 5 °C et procéder au dosage par chromatographie en phase liquide à haute performance dans les 24 h suivant la préparation. 4.2. Chromatograhie en phase liquide à haute performance Phase mobile : tampon acétate/acétonitrile (2.15) Régler le débit de la phase mobile dans la colonne à 2,0 ml/minute + 0,5 ml/minute. Régler la longueur d'onde du détecteur à 240 nm. 4.2.1. Etalonnage Injecter 10 |gml de chacune des solutions standards de conservateur (2.17) dans le chromatographe en phase liquide (3.2). Etablir les rapports entre les hauteurs de pic des conservateurs à doser et la hauteur du pic de l'étalon interne à partir des chromatogrammes obtenus. Pour chaque conservateur, tracer une courbe reliant ce rapport à la concentration de chaque solution standard.

Vérifier qu'une réponse linéaire est obtenue. 4.2.2. Dosage Injecter 10 |gml d'extrait échantillon (4.1.1) dans le chromatographe en phase liquide (3.2) et enregistrer un chromatogramme. Injecter 10 |gml de solution standard de chacun des conservateurs (2.17) et enregistrer un chromatogramme. Comparer les chromatogrammes obtenus.

Si le chromatogramme de l'extrait échantillon (4.1.1) ne présente aucun pic ayant approximativement le même temps de rétention que l'acide 2-méthoxybenzoïque (étalon interne recommandé), injecter 10 |gml d'extrait échantillon avec étalon interne (4.1.2) et enregistrer un chromatogramme.

Si l'on observe sur le chromatogramme de l'extrait échantillon (4.1.1) un pic interférant ayant le même temps de rétention que l'acide 2-méthoxybenzoïque, il y a lieu de sélectionner un autre étalon interne approprié. Si l'un des conservateurs faisant l'objet de l'investigation ne figure pas sur le chromatogramme, il peut être pris comme étalon interne.

Vérifier que les chromatogrammes obtenus avec une solution étalon et avec la solution échantillon satisfont aux exigences suivantes : le pic de séparation de la paire la plus mal séparée doit être d'au moins 0,90 (pour la définition d'un pic de séparation, voir la figure 1).

Pour la consultation du tableau, voir image .

Si la séparation requise n'est pas obtenue, il y a lieu soit d'utiliser une colonne plus performante, soit d'ajuster la composition de la phase mobile jusqu'à satisfaction des exigences, le facteur d'asymétrie As de tous les pics obtenus doit être compris entre 0,9 et 1,5 (pour une définition du facteur d'asymétrie d'un pic, voir la figure 2). Pour l'enregistrement du chromatogramme aux fins du dosage du facteur d'asymétrie, une vitesse de déroulement du papier d'au moins 2 cm/minute est recommandée, Pour la consultation du tableau, voir image . 5. Calcul A l'aide des rapports entre les hauteurs des pics des conservateurs à doser et la hauteur du pic de l'acide 2-méthoxybenzoïque (étalon interne) ainsi que de la courbe d'étalonnage, calculer la concentration en conservateurs acides de la solution échantillon. Calculer la teneur de l'échantillon en acide benzoïque, en acide 4-hydroxybenzoïque, en acide sorbique ou en acide salicylique, en pourcentage de masse (xi), à l'aide de la formule : Pour la consultation du tableau, voir image . où : a = masse (en g) de la prise d'essai (4.1.2), b = concentration (|gmg/ml) de conservateur dans l'extrait échantillon final, obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage. 6. Répétabilité (1) Pour une teneur en acide 4-hydroxybenzoïque de 0,40 %, la différence entre les résultats des deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne devrait pas excéder une valeur absolue de 0,035 %. Pour une teneur en acide benzoïque de 0,50 %, la différence entre les résultats des deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne devrait pas excéder une valeur absolue de 0,050 %.

Pour une teneur en acide salicylique de 0,50 %, la différence entre les résultats des deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne devrait pas excéder une valeur absolue de 0,045 %.

Pour une teneur en acide sorbique de 0,60 %, la différence entre les résultats des deux déterminations effectuées en parallèle sur le même échantillon ne devrait pas excéder une valeur absolue de 0,035 %. 7. Remarques 7.1. Les résultats d'un test de robustesse effectué sur cette méthode indiquent que la quantité d'acide sulfurique ajouté afin d'extraire les acides de l'échantillon est critique; il y a donc lieu de respecter les limites prescrites pour la quantité d'échantillon utilisée. 7.2. Si on le souhaite, il est possible d'utiliser une précolonne appropriée.

C. DOSAGE DE L'ACIDE PROPIONIQUE 1. Objet et champ d'application Cette méthode convient pour le dosage de l'acide propionique, à une concentration maximale de 2 % (m/m) dans tout produit cosmétique.2. Définition La concentration en acide propionique mesurée à l'aide de cette méthode est exprimée en pourcentage de masse (% m/m) du produit.3. Principe Après un traitement approprié du produit à analyser, le dosage est effectué par chromatographie en phase gazeuse avec de l'acide 2-méthylpropionique comme étalon interne.4. Réactifs Tous les réactifs doivent être de qualité analytique;il convient d'utiliser de l'eau distillée ou de l'eau d'une qualité équivalente. 4.1. Ethanol 96 % (v/v) 4.2. Acide propionique 4.3. Acide 2-méthylpropionique 4.4. Acide orthophosphorique 4.5. Solution d'acide propionique Peser approximativement 1,00 g (p gramme) d'acide propionique et compléter à 50,00 ml avec de l'éthanol (4.1). 4.6. Solution d'étalon interne Peser approximativement 1,00 g (e gramme) d'acide 2-méthylpropionique et compléter à 50,00 ml avec de l'éthanol (4.1). 5. Appareillage 5.1. Equipement normal de laboratoire, et : 5.2. Chromatographe en phase gazeuse avec détecteur à ionisation de flamme 5.3. Bain-marie à 60 °C 5.4. Tube de verre (20 x 150 mm) avec bouchon à vis 5.5. Seringue en verre de 10 ml avec membrane filtrante (pore diamètre 0,45 |gmm) 6. Mode opératoire 6.1. Préparation de l'échantillon 6.1.1. Préparation de l'échantillon sans étalon interne Dans le tube à bouchon vissé (5.3), peser approximativement 1 g d'échantillon. Ajouter 0,5 ml d'acide phosporique (4.4) et 9,5 ml d'éthanol (4.1).

Fermer le tube et agiter fortement. Si nécessaire, placer le tube dans un bain-marie chauffé à 60 °C (5.4) pendant 5 minutes, afin de dissoudre complètement la phase lipidique. Faire refroidir rapidement sous l'eau courante. Filtrer une partie de la solution sur une membrane filtrante (5.5).

Chromatographier le filtrat le jour même. 6.1.2. Préparation de l'échantillon avec étalon interne Peser à trois décimales près 1 g + 0,1 g (a gramme) d'échantillon dans un tube de verre (5.3). Ajouter 0,5 ml d'acide phosphorique (4.4), 0,50 ml de solution étalon interne (4.6) et 9 ml d'éthanol (4.1).

Fermer le tube et agiter vigoureusement. Si nécessaire, placer le tube dans un bain-marie chauffé à 60 °C (5.4) pendant 5 minutes, afin de dissoudre complètement la phase grasse. Faire refroidir rapidement sous l'eau courante. Filtrer une partie de la solution sur une membrane (5.5). Chromatographier le filtrat le jour même. 6.2 Conditions de la chromatographie en phase gazeuse.

Il est recommandé d'adopter les conditions opératoires suivantes : Colonne Pour la consultation du tableau, voir image Gaz vecteur azote débit : 25 ml/min. 6.3. Chromatographie 6.3.1. Etalonnage Dans un série de fioles jaugées de 20 ml, transférer à l'aide d'une pipette 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 et 4,00 ml de solution d'acide propionique (4.4); toujours à l'aide d'une pipette, transférer dans chaque fiole 1,00 ml de solution d'étalon interne (4.6); compléter au trait avec de l'éthanol (4.1) et mélanger. Les solutions ainsi préparées contiennent e mg/ml d'acide 2-méthylpropionique comme étalon interne (c'est-à-dire 1 mg/ml si e = 1,000) et p/4, p/2, p, 2p et 4p mg/ml d'acide propionique (c'est-à-dire : 0,25, 0,50, 1,00, 2,00 et 4,00 mg/ml si p = 1,000).

Injecter 1 |gml de chacune de ces solutions dans le chromatographe et tracer la courbe d'étalonnage en portant sur l'axe des x le rapport entre les masses d'acide propionique et d'acide 2-méthylpropionique, et sur l'axe des y le rapport des aires correspondantes.

Faire trois injections et calculer la moyenne du rapport des aires de pic. 6.3.2. Dosage Injecter 1 |gml du filtrat d'échantillon 6.1.1. Comparer le chromatogramme obtenu avec celui de l'étalon interne (6.3.1). Si un pic a approximativement le même temps de rétention que l'acide 2-méthylpropionique (R H 1,5), changer l'étalon interne. Si aucune interférence n'apparaît, injecter 1 |gml de solution 6.1.2, et mesurer les surfaces des pics d'acide propionique et des pics d'étalon interne.

Faire trois injections de chaque solution et calculer la moyenne obtenue. Calculer le rapport des surfaces. 7. Calculs 7.1. A partir de la courbe d'étalonnage tracée au point 6.3.1, noter le rapport de masses K correspondant au rapport des surfaces de pics calculé au point 6.3.2. 7.2. A partir du rapport des masses ainsi obtenu, calculer le taux d'acide propionique, en pourcentage de masse, à l'aide de la formule : Pour la consultation du tableau, voir image . où : K = rapport calculé au point 7.1, e = masse en grammes d'étalon interne, pesé au point 4.6, a = masse en grammes l'échantillon, pesé au point 6.1.2.

Arrondir les résultats à une décimale. 8. Répétabilité (2) Pour un taux d'acide propionique de 2 % (m/m), la différence entre les résultats des deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne doit pas dépasser 0,12 %. XXXVI. Identification de l'hydroquinone, du monométhyléther d'hydroquinone, du monoéthyléther d'hydroquinone et du monobenzyléther d'hydroquinone dans les produits cosmétiques A. Identification 1. Objet et champ d'application Cette méthode concerne la détection et l'identification de l'hydroquinone, du monométhyléther d'hydroquinone, du monoéthyléther d'hydroquinone et du monobenzyléther d'hydroquinone dans les produits cosmétiques destinés à éclaircir la peau.2. Principe L'hydroquinone et ses éthers sont identifiés par chromatographie sur couche mince (CCM).3. Réactifs Tous les réactifs doivent être de qualité analytique. 3.1. Ethanol à 96 % (v,v) 3.2. Chloroforme 3.3. Diéthyle oxyde 3.4. Solvant d'élution : chloroforme/diéthyle oxyde 66/33 (v/v) 3.5. Ammoniaque à 25 % (m/m) (d 20 40 = 0,91 g/ml). 3.6. Acide ascorbique 3.7. Hydroquinone 3.8. Méthyléther d'hydroquinone 3.9. Ethyléther d'hydroquinone 3.10. Benzyléther d'hydroquinone (monobenzone) 3.11. Solutions de référence Les solutions suivantes doivent être fraîchement préparées et sont stables pendant une journée. 3.11.1. Peser 0,05 g d'hydroquinone (3.7) dans un tube à essai gradué de 10 ml. Ajouter 0,250 g d'acide ascorbique (3.6) et 5 ml d'éthanol à 96 % (3.1). Ajouter de l'ammoniaque (3.5) jusqu'à pH 10 et compléter au trait avec de l'éthanol (3.1). 3.11.2. Peser 0,05 g de monométhyléther d'hydroquinone (3.8) dans un tube à essai gradué de 10 ml. Ajouter 0,250 g d'acide ascorbique (3.6) et 5 ml d'éthanol (3.1). Ajouter de l'ammoniaque (3.5) jusqu'à pH 10 et compléter au trait avec de l'éthanol (3.1). 3.11.3. Peser 0,05 g de monoéthyléther d'hydroquinone (3.9) dans un tube à essai gradué de 10 ml. Ajouter 0,250 g d'acide ascorbique (3.6) et 5 ml d'éthanol (3.1). Ajouter de l'ammoniaque (3.5) jusqu'à pH 10 et compléter au trait avec de l'éthanol (3.1). 3.11.4. Peser 0,05 g de benzyléther d'hydroquinone (3.10) dans un tube à essai gradué de 10 ml. Ajouter 0,250 g d'acide ascorbique (3.6) et 5 ml d'éthanol (3.1). Ajouter de l'ammoniaque (3.5) jusqu'à pH 10 et compléter au trait avec de l'éthanol (3.1). 3.12. Nitrate d'argent 3.13. Acide 12-phosphomolybdique 3.14. Ferrocyanure de potassium 6 H2O 3.15. Chlorure ferrique 6 H2O 3.16. Réactifs révélateurs 3.16.1. Dans une solution aqueuse de nitrate d'argent (3.12) à 5 % (m/v), ajouter de l'ammoniaque (3.5) jusqu'à dissolution du précipité obtenu.

Avertissement : la solution devient instable (avec risque d'explosion) si on la laisse reposer; il convient donc de la jeter après usage. 3.16.2. Solution à 10 % (m/v) d'acide phosphomolybdique 12 (3.13) dans de l'éthanol (3.1.). 3.16.3. Préparer une solution aqueuse à 1 % (m/v) de ferrocyanure de potassium (3.14) et une solution aqueuse à 2 % (m/v) de chlorure ferrique (3.15). Mélanger à parties égales les deux solutions juste avant utilisation. 4. Appareillage Matériel ordinaire de laboratoire, et : 4.1. Matériel ordinaire de CCM 4.2. Plaques de CCM prêtes à l'emploi : silicagel GHR/UV254' 20 x 20 cm (Machery Nagel où équivalent), épaisseur de la couche 0,25 mm 4.3. Bain à ultra-sons 4.4. Centrifugeuse 4.5. Lampe UV 254 nm 5. Mode opératoire 5.1. Préparation de l'échantillon Peser 3,0 g d'échantillon dans un tube gradué de 10 ml. Ajouter 0,250 g d'acide ascorbique (3.6) et 5 ml d'éthanol (3.1). Amener la solution à pH 10 à l'aide d'ammoniaque (3.5). Compléter au trait avec de l'éthanol (3.1). Fermer le tube avec un bouchon et homogénéiser dans un bain à ultra-sons pendant 10 minutes. Passer sur un filtre papier ou centrifuger à 3000 t/min. 5.2. CCM 5.2.1. Saturer une cuve de chromatographie avec le solvant d'élution (3.4). 5.2.2. Déposer sur une plaque 2 |gml des solutions de référence (3.11) et 2 |gml de la solution échantillon (5.1). Eluer à température ambiante dans l'obscurité jusqu'à ce que le front de solvant ait migré de 15 cm. 5.2.3. Retirer la plaque et laisser sécher à température ambiante. 5.3. Détection 5.3.1. Observer la plaque sous UV à 254 nm et repérer la position des taches. 5.3.2. Vaporiser sur la plaque : - le réactif au nitrate d'argent (3.16.1) ou - le réactif à l'acide phosphomolybdique (3.16.2) et chauffer à 120 °C environ ou - la solution de ferrocyanure de potassium et de chlorure ferrique (3.16.3). 6. Identification Calculer la valeur de Rf pour chaque tache. Comparer les taches obtenues pour la solution échantillon avec celles des solutions de référence au point de vue de leurs valeurs Rf, leur couleurs sous rayonnement UV, leur couleur après vaporisation du réactif.

Réaliser la CLHP décrite dans la partie B et comparer les temps de rétention obtenus pour le ou les pics de l'échantillon et pour ceux des solutions de référence.

Tenir compte des résultats de la CCM et de la CLHP pour identifier la présence d'hydroquinone et/ou de ses éthers. 7. Remarques Dans les conditions décrites, les Rf suivants ont été relevés : - hydroquinone : 0,32, - méthyléther d'hydroquinone : 0,53, - éthyléther d'hydroquinone : 0,55, - benzyléther d'hydroquinone : 0,58. B. DOSAGE 1. Objet et champ d'application Cette méthode décrit le dosage de l'hydroquinone, du monométhyléther d'hydroquinone, du monoéthyléther d'hydroquinone et du monobenzyléther d'hydroquinone dans les produits cosmétiques d'éclaircissement de la peau.2. Principe L'échantillon est extrait par un mélange eau/éthanol à température douce afin de fondre toute matière lipidique.Le mélange obtenu est filtré. Le dosage des composés présents dans la solution est réalisé par chromatographie liquide en phase inverse combinée à une détection UV. 3. Réactifs 3.1. Tous les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être distillée ou d'une pureté au moins équivalente. 3.2. Méthanol 3.3. Hydroquinone 3.4. Monométhyléther d'hydroquinone 3.5. Monoéthyléther d'hydroquinone 3.6. Monobenzyléther d'hydroquinone (monobenzone) 3.7. Tétrahydrofuranne pour CLHP 3.8. Mélange eau/méthanol 1/1 (v/v) Mélanger 1 volume d'eau et 1 volume de méthanol (3.2). 3.9. Phase mobile : mélange tétrahydrofuranne/eau 45 : 55 (v/v) Mélanger 45 volumes de tétrahydrofuranne (3.7) et 55 volumes d'eau. 3.10. Solution étalon Peser 0,06 g d'hydroquinone (3.3) 0,08 g de monométhyléther d'hydroquinone (3.4), 0,10 g de monoéthyléther d'hydroquinone (3.5) et 0,12 g de monobenzyléther d'hydroquinone (3.6) dans une fiole jaugée de 50 ml. Dissoudre et compléter au trait avec du méthanol (3.2).

Préparer la solution étalon en diluant 10,00 ml de cette solution dans 50,00 ml de mélange eau/méthanol (3.8). Ces solutions doivent être fraîchement préparées. 4. Appareillage Matériel ordinaire de laboratoire, et : 4.1. Bain-marie à 60 °C 4.2. Chromatographe liquide à haute performance équipé d'un détecteur UV à longueur d'onde variable et d'une boucle d'injection de 10 |gml. 4.3. Colonne Colonne chromatographique en acier inoxydable d'une longueur de 250 mm, d'un diamètre intérieur de 4,6 mm, remplie de phényle Zorbax (phénéthylsilane lié chimiquement au Zorbax SIL, « end-capped » par du triméthylchlorosilane), de granulométrie 6 |gmm, ou équivalent. Ne pas utiliser de précolonne, sauf de type phényle ou équivalent. 4.4. Papier filtre de diamètre 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband no 5982, ou équivalent. 5. Mode opératoire 5.1. Préparation de l'échantillon Peser avec une précision de trois décimales 1 g + 0,1 g (a gramme) d'échantillon dans une fiole jaugée de 50 ml. Disperser l'échantillon dans 25 ml de mélange eau/méthanol (3.8). Fermer la fiole jaugée et agiter vigoureusement jusqu'à obtention d'une suspension homogène.

Agiter pendant au moins une minute. Placer la fiole jaugée dans un bain-marie (4.1) maintenu exactement à 60 °C afin d'améliorer l'extraction. Refroidir la fiole et compléter au trait avec le mélange eau/méthanol (3.8). Passer l'extrait sur filtre papier (4.4). Procéder au dosage par CLHP dans les 24 h suivant la préparation de l'extrait. 5.2. Chromatographie liquide haute performance 5.2.1. Régler le débit de la phase mobile (3.9) à 1,0 ml/min et le détecteur à 295 nm. 5.2.2. Injecter 10 |gml de la solution échantillon obtenue selon la procédure décrite au point 5.1 et enregistrer le chromatogramme.

Mesurer les aires des pics. Réaliser un étalonnage selon la méthode décrite au point 5.2.3. Comparer les chromatogrammes obtenus avec l'échantillon et avec les solutions étalons. A l'aide des aires des pics et des valeurs des facteurs de réponse (RF) calculées au point 5.2.3, calculer la concentration des composés à analyser dans la solution échantillon. 5.2.3. Etalonnage Injecter 10 |gml de la solution étalon (3.10) et enregistrer le chromatogramme. Faire plusieurs injections jusqu'à obtention d'une aire de pic constante.

Déterminer le facteur de réponse RFi : Pour la consultation du tableau, voir image . où : pi = aire du pic pour l'hydroquinone, le monométhyléther d'hydroquinone, le monoéthyléther d'hydroquinone, le monobenzyléther d'hydroquinone, ci = concentration (g/50 ml), dans la solution étalon (3.10), d'hydroquinone, de monométhyléther d'hydroquinone, de monoéthyléther d'hydroquinone, de monobenzyléther d'hydroquinone.

Vérifier que les chromatogrammes obtenus pour la solution étalon et la solution échantillon obéissent aux conditions suivantes.

Le pic de séparation de la paire la plus mal séparée doit être d'au moins 0,90. Pour une définition de la séparation des pics, voir figure 1.

Pour la consultation du tableau, voir image .

Si la séparation requise n'est pas obtenue, il convient soit d'utiliser une colonne plus performante, soit d'ajuster la composition de la phase mobile jusqu'à obtention de résultats satisfaisants.

Le facteur d'asymétrie As de tous les pics obtenus doit être compris entre 0,9 et 1,5 (pour une définition du facteur d'asymétrie, voir figure 2). Pour l'enregistrement du chromatogramme en vue de la détermination du facteur d'asymétrie, une vitesse de 2 cm/min est recommandée.

Pour la consultation du tableau, voir image .

Une ligne de base régulière doit être obtenue. 6. Calcul Utiliser l'aire des pics des composés à analyser pour calculer leur concentration (Xi) des composés à analyser dans l'échantillon, en pourcentage de masse à l'aide de la formule : où : a= masse de l'échantillon en grammes, bi = aire du pic du composé à analyser dans l'échantillon. RFi a = facteur du réponse (5.2.3) Pour la consultation du tableau, voir image .

Répétabilité (3) 7.1. Pour une teneur de 2,0 % en hydroquinone, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,13 %. 7.2. Pour une teneur de monométhyléther de 1,0 %, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,1 %. 7.3. Pour une teneur de monoéthyléther de 1,0 %, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,11 %. 7.4. Pour une teneur de monobenzyléther de 1,0 %, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,11 %. 8. Reproductibilité (3) 8.1. Pour une teneur en hydroquinone de 2,0 %, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon dans des conditions différentes (laboratoire, opérateur ou appareillage différent, et/ou moment différent) ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,37 %. 8.2. Pour une teneur de 1,0 % en monométhyléther, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon dans des conditions différentes (laboratoire, opérateur ou appareillage différent, et/ou moment différent) ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,21 %. 8.3. Pour une teneur de 1,0 % en monoéthyléther, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon dans des conditions différentes (laboratoire, opérateur ou appareillage différent, et/ou moment différent) ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,19 %. 8.4. Pour une teneur de 1,0 % en monobenzyléther, l'écart entre les résultats de deux dosages effectués en parallèle sur le même échantillon dans des conditions différentes (laboratoire, opérateur ou appareillage différent, et/ou moment différent) ne doit pas dépasser une valeur absolue de 0,11 %. 9. Remarques 9.1. Lorsque la teneur en hydroquinone obtenue dépasse largement 2 % et qu'une estimation précise de la teneur est requise, il convient de diluer l'échantillon (5.1) à une concentration similaire à celle qui serait obtenue avec un échantillon contenant 2 % d'hydroquinone, et de répéter le dosage (sur certains appareils, l'absorbance peut se situer en dehors de la gamme linéaire du détecteur pour des concentrations élevées d'hydroquinone). 9.2. Interférences La méthode décrite permet le dosage de l'hydroquinone et de ses éthers en une seule opération en mode isocratique. L'utilisation d'une colonne de phényle assure une rétention suffisante de l'hydroquinone, qui ne peut par contre être garantie dans le cas d'une colonne C 18, avec la phase mobile indiquée.

Toutefois, cette méthode est sensible à des interférences dues aux parabens. En pareil cas, le dosage doit être répété avec un système de phases mobile et stationnaire différent. Des méthodes adéquates figurent dans les références (4) et (5), à savoir : colonne : Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 cm, ou équivalent, - température : 36 °C, - débit : 1,5 ml/min, - phase mobile : - pour l'hydroquinone : méthanol/eau 5/95 (v/v), - pour le méthyléther d'hydroquinone : méthanol/eau 30/70 (v/v), - pour le benzyléther d'hydroquinone : méthanol/eau 80/20 (v/v) (1); colonne : Spherisorb S5-ODS ou équivalent, - phase mobile : eau/méthanol 90/10 (v/v), - débit : 1,5 ml/min.

Ces conditions conviennent pour l'hydroquinone (2).

XXXVII. Identification et dosage du phénoxy-2-éthanol, du phénoxy-1-propanediol, des hydroxy-4-benzoates de méthyle, d'éthyle, de propyle, de butyle et de benzyle dans les produits cosmétiques A. Identification 1. Objet et champ d'application Cette méthode décrit une chromatographie en couche mince qui, combinée à la méthode d'analyse décrite à la section B, permet l'identification du phénoxy-2-éthanol, du phénoxy-1-propanediol, des hydroxy-4-benzoates de méthyle, d'éthyle, de propyle, de butyle et de benzyle dans les produits cosmétiques.2. Principe Les conservateurs sont extraits par l'acétone de l'échantillon acidifié.Après filtration, la solution acétonique est mélangée à de l'eau et les acides gras sont précipités en milieu alcalin sous forme de sels de calcium. Le mélange eau/acétone est extrait par l'éther diéthylique pour séparer les substances lipophiles. Après acidification, les conservateurs sont extraits par l'éther diéthylique pour séparer les substances lipophiles. Après acidification, les conservateurs sont extraits par l'éther diéthylique. Une partie aliquote de l'extrait est déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince recouverte de gel de silice. Après développement de la plaque, le chromatogramme obtenu est observé sous lumière ultraviolette et révélé par le réactif de Millon. 3. Réactifs 3.1. Généralités Tous les réactifs utilisés doivent être de pureté analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente 3.2. Acétone 3.3. Ether diéthylique 3.4. n-Pentane 3.5. Méthanol 3.6. Acide acétique pur 3.7. Acide chlorhydrique en solution, c (HCl) = 4 mol/l 3.8. Hydroxyde de potassium en solution, c (KOH) = 4 mol/l 3.9. Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O) 3.10. Réactif révélateur : réactif de Millon.

Le réactif de Millon (nitrate mercurique) est une solution toute prête en vente dans le commerce (Fluka 69820 ou équivalent) 3.11. Phénoxy-2-éthanol 3.12. Phénoxy-1-propanediol 3.13. Hydroxy-4-benzoate de méthyle (méthyl paraben) 3.14. Hydroxy-4-benzoate d'éthyle (éthyl paraben) 3.15. n-Hydroxy-4-benzoate de propyle (propyl paraben) 3.16. n-Hydroxy-4-benzoate de butyle (butyl paraben) 3.17. Hydroxy-4-benzoate de benzyle (benzyl paraben) 3.18. Solutions de référence Préparer des solutions à 0,1 % (m/V) des substances de référence des points 3.11, 3.12, 3.13,3.14,3.15, 3.16 et 3.17 dans du méthanol 3.19. Solvant de développement Mélanger 88 volumes de n-pentane (point 3.4) avec 12 volumes d'acide acétique (point 3.6) pur 4. Appareillage Equipement courant de laboratoire ainsi que : 4.1. bain-marie, capable de maintenir une température de 60 °C 4.2. cuve de développement (dépourvue de papier-filtre) 4.3. source de lumière ultraviolette, 254 nm 4.4. plaques pour chromatographie en couche mince, 20 cm x 20 cm, recouvertes de gel de silice 60 F 254r avec zone de concentration (Merck no 11798, Darmstadt ou équivalent) 4.5. étuve capable de maintenir des températures allant jusqu'à 105 °C 4.6. sèche-cheveux à air chaud 4.7. rouleau à peindre en laine, longueur approximative : 10 cm, diamètre extérieur : environ 3,5 cm. L'épaisseur de la couche de laine doit être d'environ 2 à 3 mm. Désépaissir la laine si nécessaire (voir remarque au point 5.2) 4.8. tubes de verre de 50 ml avec bouchon à vis 4.9. plaque chauffante électrique avec thermostat. Réglage de température : environ 80 °C. La plaque chauffante sera recouverte d'une plaque d'aluminium de 20 cm x 20 cm et d'une épaisseur de 6 mm environ afin d'obtenir une distribution uniforme de la chaleur 5. Mode opératoire 5.1. Préparation des échantillons Placer environ 1 g d'échantillon dans un tube en verre de 50 ml (point 4.8) et ajouter 4 gouttes d'acide chlorhydrique en solution (point 3.7) et 40 ml d'acétone.

Pour des produits cosmétiques très basiques, comme le savon de toilette, 20 gouttes d'acide chlorhydrique en solution seront ajoutées. Fermer le tube, porter doucement le mélange à une température de 60 °C environ afin de faciliter l'extraction des conservateurs en phase acétonique et agiter vigoureusement pendant une minute.

Mesurer le pH de la solution avec du papier indicateur de pH et ajuster ce pH à une valeur < 3 par l'acide chlorhydrique en solution.

Agiter à nouveau vigoureusement pendant une minute.

Laisser refroidir la solution à température ambiante et filtrer sur papier filtre dans une fiole conique. Transférer 20 ml de ce filtrat dans une fiole conique de 200 ml, ajouter 60 ml d'eau et mélanger.

Ajuster le pH du mélange à 10 environ à l'aide d'hydroxyde de potassium en solution (point 3.8), en utilisant du papier indicateur de pH. Ajouter 1 g de chlorure de calcium dihydraté (point 3.9) et agiter vigoureusement. Filtrer la solution sur papier filtre dans une ampoule à décanter de 250 ml contenant 75 ml d'éther diéthylique et secouer vigoureusement pendant une minute. Laisser les phases se séparer et recueillir la couche aqueuse dans une fiole conique de 200 ml. Ajuster le pH de la solution à 2 environ à l'aide d'acide chlorhydrique en solution en utilisant du papier indicateur de pH. Ajouter ensuite 10 ml d'éther diéthylique et agiter vigoureusement pendant une minute.

Laisser les phases se séparer et transférer environ 2 ml de la couche d'éther diéthylique dans un flacon échantillon de 5 ml. 5.2. Chromatographie en couche mince Placer une plaque pour chromatographie en couche mince (point 4.4) sur la plaque d'aluminium chauffée (point 4.9), déposer 10 |gml de chacune des solutions de référence (point 3.18) et 100 |gml de l' (des) échantillon(s) en solution (point 5.1) sur la ligne de départ dans la zone de concentration de la plaque pour chromatographie en couche mince.

Si nécessaire, il est possible d'utiliser un flux d'air pour faciliter l'évaporation du solvant. Oter la plaque pour chromatographie en couche mince de la plaque chauffante et la laisser refroidir à température ambiante. Verser 100 ml du solvant de développement (point 3.19) dans la cuve (point 4.2). Placer la plaque pour chromatographie en couche mince immédiatement dans la cuve non saturée et développer à température ambiante jusqu'à ce que le front de solvant soit à 15 cm de la ligne de base. Oter la plaque de la cuve de développement et sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.

Examiner la plaque sous lumière ultraviolette (point 4.3) et marquer la position des taches. Chauffer la plaque pendant 30 minutes à l'étuve (point 4.5) à 100 °C pour éliminer l'acide acétique excédentaire. Révéler les conservateurs sur le chromatogramme à l'aide de la solution de nitrate mercurique (point 3.10), en trempant le rouleau à peindre (point 4.7) dans ce réactif et en le faisant rouler sur la plaque pour chromatographie en couche mince jusqu'à ce qu'elle soit uniformément humidifiée.

Remarque : Les taches peuvent également être révélées en appliquant précautionneusement une goutte de solution de nitrate mercurique sur chacune des taches visualisées sous lumière ultraviolette.

Les esters de l'acide hydroxy-4-benzoïque apparaissent alors sous forme de taches rouges, tandis que le phénoxy-2-éthanol et le phénoxy-1-propanediol se manifestent sous forme de taches jaunes.

L'acide hydroxy-4-benzoïque lui-même, qui peut être présent dans les échantillons en tant que conservateur ou produit de la décomposition des parahydrobenzoates, apparaîtra sous la forme d'une tache rouge (points 7.3 et 7.4). 6. Identification Calculer la valeur du Rf pour chaque tache.Comparer les taches obtenues à partir de l'échantillon en solution avec celles obtenues avec les solutions de référence en considérant la valeur de leur Rf, leur comportement sous l'effet des rayons ultraviolets et leur couleur après révélation. En déduire les conclusions préliminaires sur l'identité des conservateurs. En présence de parahydrobenzoates, la procédure de chromatographie liquide haute performance (CLHP) décrite au point B doit être appliquée. Combiner les résultats de la chromatographie en couche mince et de la CLHP pour confirmer la présence de phénoxy-2-éthanol, de phénoxy-1-propanediol et des parahydroxybenzoates. 7. Remarques 7.1. En raison de la toxicité de la solution de nitrate mercurique, ce réactif doit être appliqué selon l'une des procédures décrites. La vaporisation du réactif n'est pas recommandée. 7.2. D'autres composants contenant des groupes hydroxyles peuvent également se colorer en présence de la solution de nitrate mercurique.

On trouvera une table des couleurs et des valeurs de Rf d'un certain nombre de conservateurs dans la publication suivante : N. De Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1987) Determination of preservatives in cosmetic products I :Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatoghraphy 410, 395-411). 7.3. Les valeurs de Rf figurant dans le tableau suivant sont une indication des chiffres qui peuvent être obtenus.

Pour la consultation du tableau, voir image 7.4. Aucune séparation n'est obtenue pour l'acide hydroxy-4-benzoïque et le parahydrobenzoate de méthyle ou pour le parahydrobenzoate de benzyle et le parahydrobenzoate d'éthyle. L'identification de ces composés doit être confirmée par une CLHP décrite au point B en comparant les temps de rétention obtenus à partir des échantillons et des solutions de référence.

B. DOSAGE 1. Objet et champ d'application Cette méthode décrit le dosage du phénoxy-2-éthanol, du phénoxy-1-propanediol, des hydroxy-4-benzoates de méthyle, d'éthyle, de propyle, de butyle et de benzyle dans les produits cosmétiques.2. Définition Les quantités de conservateurs dosées selon cette méthode sont exprimées en pourcentage par rapport à la masse.3. Principe L'échantillon est acidifié par de l'acide sulfurique puis mis en suspension dans un mélange d'éthanol et d'eau.Après avoir été chauffé doucement pour fondre la phase lipidique afin de faciliter l'extraction quantitative, le mélange est filtré.

Les conservateurs présents dans le filtrat sont dosés par CLHP en phase inverse en utilisant comme étalon interne hydroxy-4-benzoate d'isopropyle. 4. Réactifs 4.1. Généralités Tous les réactifs utilisés doivent être analytiquement purs. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente 4.2. Ethanol absolu 4.3. Phénoxy-2-éthanol 4.4. Phénoxy-1-propanediol 4.5. Hydroxy-4-benzoate de méthyle (méthyl parahydrobenzoate) 4.6. Hydroxy-4-benzoate d'éthyle (éthyl parahydrobenzoate) 4.7. Hydroxy-4-benzoate de n-propyle (propyl parahydrobenzoate) 4.8. Hydroxy-4-benzoate d'isopropyle (isopropyl parahydrobenzoate) 4.9. Hydroxy-4-benzoate de n-butyle (butyl parahydrobenzoate) 4.10. Hydroxy-4-benzoate de benzyle (benzyl parahydrobenzoate) 4.11. Tétrahydrofurane 4.12. Méthanol 4.13. Acétonitrile 4.14. Acide sulfurique en solution, c(H2SO4) = 2 mol/l 4.15. Mélange éthanol/eau : Mélanger 9 volumes d'éthanol (4.2) et 1 volume d'eau 4.16. Solution d'étalon interne Peser avec précision environ 0,25 g de hydroxy-4-benzoate d'isopropyle (point 4.8) dans une fiole conique de 500 ml. Dissoudre et compléter avec le mélange éthanol/eau (point 4.15) 4.17. Phase mobile Mélanger 5 volumes de tétrahydrofurane, 60 volumes d'eau, 10 volumes de méthanol et 25 volumes d'acétonitrile 4.18. Solution mère de conservateurs Peser avec soin environ 0,2 g de phénoxy-2-éthanol, 0,2 g de phénoxy-1-propanediol, 0,05 g de parahydrobenzoate de méthyle, 0,05 g de parahydrobenzoate d'éthyle, 0,05 g de parahydrobenzoate de propyle, 0,05 g de parahydrobenzoate de butyle, 0,025 g de parahydrobenzoate de benzyle, dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre et compléter au volume avec le mélange éthanol/eau.

La solution reste stable pendant une semaine au réfrigérateur 4.19. Solution étalon des conservateurs A partir de la solution mère (point 4.18), transférer respectivement 20 ml, 10 ml, 5 ml, 2 ml et 1 ml dans des fioles jaugées de 50 ml.

Ajouter dans chaque fiole 10 ml de la solution d'étalon interne (point 4.16) et 1 ml d'acide sulfurique en solution (point 4.14). Compléter le volume par le mélange éthanol/eau. Ces solutions doivent être préparées extemporanément 5. Appareillage Equipement courant de laboratoire ainsi que : 5.1. bain-marie, capable de maintenir une température de 60 °C ± "1 °C. 5.2. chromatographe liquide à haute performance avec détecteur ultraviolet, longueur d'ondes 280 mm 5.3. colonne : acier inoxydable, 25 cm x 4,6 mm O intérieur (ou 12,5 cm x 4,6 mm O intérieur) remplie de Nucléosil 5C18 ou équivalent (point 10.1). 5.4. tubes en verre de 100 ml avec bouchon à vis 5.5. chips de carborundum facilitant l'ébullition, taille 2 à 4 mm, ou équivalent 6. Mode opératoire 6.1. Préparation des échantillons 6.1.1. Préparation des échantillons sans addition d'étalon interne Mesurer avec précision environ 1 g d'échantillon dans un tube en verre de 100 ml avec bouchon à vis. Introduire dans le tube à l'aide d'une pipette 1 ml d'acide sulfurique en solution (point 4.14) et 50 ml du mélange éthanol/eau (point 4.15). Ajouter environ 1 g de chips (point 5.5), fermer le tube et agiter vigoureusement jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène (au moins une minute). Placer le tube pendant 5 minutes dans un bain-marie (point 5.1) à 60 °C ± 1 °C pour faciliter l'extraction des conservateurs dans la phase éthanolique.

Refroidir immédiatement le tube dans un flux d'air froid et conserver l'extrait au réfrigérateur pendant une heure. Filtrer l'extrait sur papier filtre. Transférer environ 2 ml du filtrat dans un flacon d'échantillonnage de 5 ml. Conserver les extraits au réfrigérateur et procéder à l'analyse par CLHP dans les 24 heures. 6.1.2. Préparation des échantillons avec addition d'étalon interne Peser à trois décimales près 1,0 g ± 0,1 g d'échantillon dans un tube en verre de 100 ml avec bouchon à vis.

Ajouter avec une pipette 1 ml d'acide sulfurique en solution et 40 ml du mélange éthanol/eau. Ajouter environ 1 g de chips (point 5.5) et exactement 10 ml de solution d'étalon interne. Fermer le tube et agiter vigoureusement jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène (au moins une minute). Placer le tube pendant 5 minutes dans un bain-marie à 60 °C ± 1 °C pour faciliter l'extraction des conservateurs dans la phase éthanolique.

Refroidir immédiatement le tube dans un jet d'eau courante froide et conserver l'extrait au réfrigérateur pendant une heure. Filtrer l'extrait sur papier filtre.

Transférer environ 2 ml du filtrat dans un flacon d'échantillonnage de 5 ml (solution-test). Conserver les extraits au réfrigérateur et procéder à l'analyse par CLHP dans les 24 heures. 6.2. Chromatographie liquide haute performance 6.2.1. Conditions chromatographiques - Phase mobile : mélange tétrahydrofurane/eau/méthanol/acétonitrile (point 4.17) - Débit : 1,5 ml/minute - Longueur d'onde de détection : 280 nm 6.2.2. Etalonnage Injecter dans le chromoatographe 10 |gml de chacune des solutions de référence de conservateur (point 4.19). A partir des chromatogrammes ainsi obtenus, déterminer les rapports entre les hauteurs des pics des solutions de référence et la hauteur du pic de la solution d'étalon interne. Pour chaque conservateur tracer une courbe reliant ces rapports aux concentrations des solutions de référence. 6.2.3. Dosage Injecter dans le chromatographe 10 |gml de la solution échantillon sans étalon interne (point 6.1.1) et enregistrer le chromatogramme.

Injecter 10 |gml de la solution de référence des conservateurs (point 4.19) et enregistrer le chromatogramme. Comparer les chromatogrammes ainsi obtenus.

Si dans le chromatogramme de l'extrait échantillon (point 6.1.1) aucun pic ne présente un temps de rétention voisin de celui de l'hydroxy-4-benzoate d'isopropyle (étalon interne recommandé), poursuivre en injectant 10 |gml de la solution échantillon avec étalon interne (point 6.1.2). Enregistrer le chromatogramme et mesurer la hauteur des pics.

Si l'on observe, dans le chromatogramme de la solution échantillon, un pic ayant à peu près le même temps de rétention que celui de l'hydroxy-4-benzoate d'isopropyle, un autre étalon interne devra être choisi.

Si l'un des conservateurs de référence est absent du chromatogramme de l'échantillon, ce conservateur peut tenir lieu d'étalon interne.

Calculer les rapports entre les hauteurs de pic des conservateurs analysés et la hauteur de pic de l'étalon interne.

S'assurer que pour les solutions étalons utilisées la courbe d'étalonnage est une droite.

S'assurer que les chromatogrammes obtenus pour la solution de référence (point 4.19) et pour l'échantillon en solution respectent les spécifications suivantes. - la séparation des pics de la paire la plus mal séparée doit être d'au moins 0,90 (définition de la séparation des pics, voir figure 1).

Pour la consultation du tableau, voir image .

Figure 1 : Séparation des pics Si la séparation requise n'est pas atteinte, il est nécessaire soit d'utiliser une colonne plus efficace, soit d'ajuster la composition de la phase mobile jusqu'à ce que les spécifications soient respectées.

Le facteur d'asymétrie As de tous les pics obtenus ira de 0,9 à 1,5 (pour une définition du facteur d'asymétrie des pics, voir figure 2).

Pour enregistrer le chromatogramme pour la détermination du facteur d'asymétrie, une vitesse de déroulement du papier enregistreur d'au moins 2 cm/minute est recommandée.

Pour la consultation du tableau, voir image .

Figure 2 : facteur d'asymétrie des pics - Une ligne de base stable devra être obtenue. 7. Calcul Utiliser la courbe d'étalonnage (point 6.2.2) et les rapports entre les hauteurs de pics des conservateurs à doser et les hauteurs de pics de la solution d'étalon interne pour calculer la concentration des conservateurs dans l'échantillon. Calculer le contenu en phénoxy-2-éthanol, de phénoxy-1-propanediol, d'hydroxy-4-benzoates de méthyle, d'éthyle, de propyle, de butyle et de benzyle, wi, sous forme de pourcentage par rapport au poids (% m/m), en utilisant la formule suivante : où : bi = la concentration (|gmg/ml) de conservateur i dans la solution échantillon selon lecture de la courbe d'étalonnage et a = la masse (g) de la prise d'essai. 8. Répétabilité (6) Voir point 10.5 9. Reproductibilité (6) (6) Voir point 10.5 10. Remarques 10.1. Phase stationnaire La rétention des solutés dans le dosage par CLHP dépend fortement du type, de la marque et de l'histoire de la phase stationnaire. Il est possible de savoir si une colonne est utilisable pour la séparation des conservateurs étudiés (point 6.2.3) en se basant sur les résultats obtenus à partir des solutions de référence. Outre les matériaux de remplissage proposés dans la méthode, on peut également utiliser l'Hypersil ODS et le Zorbax ODS. On peut aussi optimiser la composition de la phase mobile recommandée dans le but d'obtenir la séparation souhaitée. 10.2. Longueur d'onde Un test de robustesse effectué sur la méthode décrite a montré qu'un léger changement dans la longueur d'onde de détection peut avoir une influence importante sur les résultats de l'analyse.

Dès lors, ce paramètre doit être soigneusement contrôlé au cours de l'analyse. 10.3. Interférences Dans les conditions décrites dans cette méthode, de nombreux autres composants, tels que des conservateurs et des additifs cosmétiques, sont également élués. Les temps de rétention d'un grand nombre de conservateurs mentionnés dans l'annexe VI de la directive du Conseil sur les produits cosmétiques sont cités dans : N. De Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1989) Determination of preservatives in cosmetic products II. High performance liquid chromatographic identification (J. Chromatography 469, 317-398). 10.4. Pour protéger la colonne analytique, une colonne de protection adéquate doit être utilisée. 10.5. La méthode a été contrôlée au cours d'un essai mené par neuf laboratoires travaillant en collaboration. Trois échantillons ont été analysés. Le tableau suivant exprime, pour chacun des échantillons : les moyennes en % m/m (m), la répétabilité (r) et la reproductibilité (R) pour les conservateurs concernés.

Pour la consultation du tableau, voir image Vu pour être annexé à Notre arrêté du 16 avril 1998.

ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique et des Pensions, M. COLLA (1) Selon ISO 5725.(2) Selon ISO 5725.(3) Selon ISO 5725.(4) M.Herpol-Borremans en M.O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau, Int. J. Cosmet. Sci. 8, 203-214 (1986). (5) J.Firth and I. Rix. Determination of Hydriquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129. (6) Selon ISO 5725.