14 DECEMBER 1998. - Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaarlijk kunnen zijn voor de mens of voor zijn leefmilieu

ALBERT II, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet.

Gelet op de wet van 24 februari 1921 betreffende het verhandelen van giftstoffen, slaapmiddelen en verdovende middelen, ontsmettingsstoffen en antiseptica, inzonderheid op artikel 1, gewijzigd bij de wetten van 11 maart 1958, 1 juli 1976 en 14 juli 1994;

Gelet op de wet van 4 augustus 1996 betreffende het welzijn van de werknemers bij de uitvoering van hun werk;

Gelet op de wet van 28 mei 1956 betreffende ontplofbare en voor deflagratie vatbare stoffen en mengsels en de daarmee geladen tuigen;

Gelet op de wet van 11 juli 1969 betreffende de bestrijdingsmiddelen en de grondstoffen voor de landbouw, tuinbouw, bosbouw en veeteelt;

Gelet op de wet van 24 januari 1977 betreffende de bescherming van de gezondheid van de verbruikers op het stuk van de voedingsmiddelen en andere produkten, gewijzigd bij de wet van 22 maart 1989;

Gelet op de wet van 14 juli 1991 betreffende de handelspraktijken en de voorlichting en bescherming van de consument, gewijzigd bij de wet van 5 november 1993;

Gelet op de richtlijn 67/548/EEG van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 27 juni 1967 betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen van de Lid-Staten inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen, laatstelijk gewijzigd bij de richtlijn 96/56/EG van het Europees Parlement en de Raad van 3 september 1996;

Gelet op de richtlijn 94/69/EG van de Commissie van 19 december 1994 tot eenentwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen;

Gelet op de richtlijn 96/54/EG van de Commissie van 30 juli 1996 tot tweeëntwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtlelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijk stoffen;

Gelet op het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaarlijk kunnen zijn voor de mens of voor zijn leefmilieu, gewijzigd bij de koninklijke besluiten van 14 februari 1985, 14 september 1989, van 19 juli 1994 en van 13 november 1997, alsook op het koninklijk besluit van 14 september 1993 tot aanstelling van de diensten en ambtenaren belast met het opsporen en vaststellen van de inbreuken op de bepalingen van voormeld koninklijk besluit van 24 mei 1982;

Gelet op het koninklijk besluit van 27 oktober 1988 betreffende de toepassing van de beginselen van goede laboratoriumpraktijken en het toezicht op de uitvoering ervan bij proeven op scheikundige stoffen alsook op het koninklijk besluit van 14 november 1993 betreffende de bescherming van proefdieren;

Gelet op het koninklijk besluit van 11 januari 1993 tot regeling van de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke preparaten met het oog op het op de markt brengen of het gebruik ervan gewijzigd door het koninklijk besluit van 23 juni 1995, en het koninklijk besluit van 14 juli 1998;

Gelet op het advies van de Hoge Raad voor Preventie en Bescherming op het Werk van 16 oktober 1998;

Gelet op de wetten op de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973, inzonderheid op artikel 3, § 1, gewijzigd door de wetten van 9 augustus 1980, 16 juni 1989 en 4 juli 1989;

Gelet op de dringende noodzakelijkheid;

Overwegende dat richtlijn 94/69/EG van 19 december 1994, waarvan de omzettingstermijn verstreken is sedert 1 september 1996 en richtlijn 96/54/EG van 30 juli 1996 waarvan de omzettingstermijn verstreken is, deels sedert 31 otober 1997 en voor het overige sedert 31 mei 1998, onverwijld moeten worden omgezet.

Overwegende dat het Hof van Justitie van de Europese Gemeenschappen op 6 oktober 1998 Belgïe heeft veroordeeld wegens niet omzetting van de richtlijn 94/69/EG van 19 december 1994 in de Zaak C-79/98;

Op de voordracht van Onze Minister van Volksgezondheid, van Onze Minister van Tewerkstelling en Arbeid en van Onze Staats- secretaris voor Leefmilieu, Hebben Wij besloten en besluiten Wij :

Artikel 1.De bijlagen van het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaarlijk kunnen zijn voor de mens of voor zijn leefmilieu, gewijzigd bij de koninklijke besluiten van 14 februari 1985, 14 september 1989, 19 juli 1994 en 13 november 1997 worden als volgt gewijzigd : - Bijlage I wordt vervangen door bijlage I bij dit besluit; - Bijlage V, deel B, wordt als volgt gewijzigd : a) De tekst in bijlage II, onder A, van dit besluit vervangt de titel en de algemene inleiding van deel B "Methoden voor de bepaling van de toxiciteit". b) De tekst in bijlage II, onder B, van dit besluit wordt ingevoegd na hoofdstuk B.1 bis. c) De tekst in bijlage II, onder C, van dit besluit vervangt hoofdstuk B.6. d) De tekst in bijlage II, onder D, van dit besluit vervangt hoofdstuk B.7. e) De tekst in bijlage II, onder E, van dit besluit wordt toegevoegd. - De tekst in bijlage III van dit besluit vervangt de aangegeven tekst van bijlage VI.

Art. 2.Onze Minister van Volksgezondheid, Onze Minister van Tewerkstelling en Arbeid en Onze Staatssecretaris voor Leefmilieu zijn, ieder wat hem betreft, belast met de uitvoering van dit besluit.

Gegeven te Brussel, 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS

Bijlage 1 Lijst van de gevaarlijke stoffen Als lijst van de gevaarlijke stoffen voor deze bijlage geldt de bijlage III, deel I, van het koninklijk besluit van 11 januari 1993 tot regeling van de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke preparaten met het oog op het op de markt brengen of het gebruik ervan, gewijzigd door het koninklijk besluit van 23 juni 1995 en door het koninklijk besluit van 14 juli 1998;

Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS

Bijlage II A "DEEL B : METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT EN ANDERE INVLOEDEN OP DE GEZONDHEID ALGEMENE INLEIDING : DEEL B A. VERKLARENDE NOOT Voor de doeleinden van deze richtlijn wordt de volgende nummering toegepast : B.15. Genmutatie - Saccharomyces cerevisiae B.16. Mitotische recombinatie - Saccharomyces cerevisiae B.17. Genmutatietest - zoogdiercellen in vitro B.18. DNA-beschadiging en -herstel - DNA-herstelsynthese - zoogdiercellen in vitro B.19. Zusterchromatiden-uitwisselingstest in vitro B.20. Test op recessief-letale mutaties van geslachtsgebonden genen bij Drosophila melanogaster B.21. Transformatietest op zoogdiercellen in vitro B.22. Test op dominant-letale mutaties bij knaagdieren B.23. Cytogenetisch onderzoek van geslachtscellen van zoogdieren in vivo B.24. Vlekkentest op muizen B.25. Erfelijke translocaties bij de muis B.26. Subchronische orale toxiciteitstest : 90-daagse herhaalde orale toediening aan knaagdiersoorten B.27. Subchronische orale toxiciteitstest : 90-daagse herhaalde orale toediening aan niet-knaagdiersoorten B.28. Subchronische dermale toxiciteitstest : 90-daagse herhaalde dermale toediening aan knaagdiersoorten B.29. Subchronische inhalatietoxiciteitstest : 90-daagse herhaalde inhalatoire toediening aan knaagdiersoorten B.30. Chronische-toxiciteitstest B.31. Teratogeniteitstest bij knaagdieren en niet-knaagdieren B.32. Carcinogeniteitstest B.33. Gecombineerde test op chronische toxiciteit en carcinogeniteit B.34. Test op reproduktietoxiciteit over één generatie B.35. Test op reproduktietoxiciteit over twee generaties B.36. Toxicokinetica B. ALGEMENE DEFINITIES VAN DE BEGRIPPEN DIE GEBRUIKT WORDEN BIJ DE TESTMETHODEN IN DEZE BIJLAGE i) Acute toxiciteit omvat de schadelijke effecten die binnen een gegeven tijd (meestal 14 dagen) na de toediening van een enkelvoudige dosis van een stof optreden. ii) Manifeste toxiciteit is een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een risicobepaling mogelijk maken en van een zodanige aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden. iii) Dosis is de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht (gram of milligram) of als het gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bij voorbeeld mg per kg lichaamsgewicht) of als constante concentratie in het dieet (ppm, delen per miljoen of mg per kg voedsel). iv) Discriminerende dosis is het hoogste van de vier vaste dosisniveaus dat kan worden toegediend zonder dat met de teststof verband houdende sterfte wordt veroorzaakt (met inbegrip van de proefdieren die moeten worden afgemaakt). v) Dosering is een algemeen begrip dat de dosis, de frequentie en de duur van de toediening omvat. vi) LD50 (letale-dosismediaan) is de statistisch vastgestelde enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de dieren die de dosis hebben ontvangen de dood intreedt. De LD50-waarde wordt uitgedrukt in het gewicht van de teststof per gewichtseenheid proefdier (mg/kg). vii) LC50 (letale-concentratiemediaan) is de statistisch vastgestelde concentratie van een stof waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de gedurende een bepaalde tijd blootgestelde dieren, tijdens de blootstelling of binnen een bepaalde tijd na de blootstelling de dood intreedt.

De LC50-waarde wordt uitgedrukt in het gewicht van de teststof per standaardvolume lucht (mg/l). viii) NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) is de afkorting voor de hoogste dosis of het hoogste niveau van blootstelling waarbij nog geen waarneembare toxiciteitsverschijnselen optreden die verband houden met de behandeling. ix) Subchronische toxiciteit bij herhaalde dosis omvat de schadelijke effecten die optreden bij proefdieren ten gevolge van herhaalde dagelijkse toediening van, of blootstelling aan een chemische stof gedurende een kort gedeelte van hun verwachte levensduur. x) De maximale verdraagbare dosis (Maximum Tolerated Dose - MTD) is het hoogste dosisniveau dat tekenen van toxiciteit bij proefdieren tot gevolg heeft zonder dat dit belangrijke gevolgen heeft voor de overleving in de test waarin ze wordt gebruikt. xi) Huidirritatie is het ontstaan van een ontstekingsreactie in de huid door het toedienen van een teststof op de huid. xii) Oogirritatie is het ontstaan van veranderingen in het oog door het toedienen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog. xiii) Sensibilisatie van de huid (allergische contactdermatitis) is een via het immuunsysteem veroorzaakte reactie van de huid op een stof. xiv) Huidaantasting is het optreden van irreversibele huidweefselbeschadiging na het toedienen van een teststof gedurende een periode van 3 minuten tot 4 uur. xv) Toxicokinetica is de bestudering van de absorptie, de distributie, het metabolisme en de excretie van teststoffen. xvi) Absorptie is het (geheel van) proces(sen) waardoor een toegediende stof het lichaam binnenkomt. xvii) Excretie is het (geheel van) proces(sen) waardoor de toegediende stof en/of de metabolieten daarvan door het lichaam worden uitgescheiden. xviii) Distributie is het (geheel van) proces(sen) waardoor de geabsorbeerde stof en/of de metabolieten daarvan over het lichaam worden verdeeld. xix) Metabolisme is het (geheel van) proces(sen) waardoor de toegediende stoffen in het lichaam chemisch worden veranderd door enzymatische of niet-enzymatische reacties.

B.I Acute toxiciteit, subchronische toxiciteit bij herhaalde dosis en chronische toxiciteit.

De acute toxicologische effecten en de orgaan- of systeemtoxiciteit van een stof kunnen worden vastgesteld via een aantal toxiciteitstesten (methoden B.1-B.5) waarmee, na toediening van een enkele dosis, een eerste indicatie van de toxiciteit kan worden verkregen.

Afhankelijk van de toxiciteit van de stof kan worden overwogen een limietproef in plaats van een volledige LD50 uit te voeren. Er is echter geen limietproef gespecificeerd bij inhalatieonderzoek omdat het niet mogelijk is gebleken om een ondubbelzinnige blootstellingslimiet bij inhalatie te definiëren.

Bij voorkeur moeten methoden worden toegepast waarbij zo weinig mogelijk proefdieren worden gebruikt en waarbij ongerief en pijn de proefdieren worden geminimaliseerd, bij voorbeeld door gebruik van de vaste-dosismethode (methode B.1 bis) en de bepaling van de acute-toxiciteitsklasse (methode B.1 ter). Bij proeven op het eerste niveau kunnen de resultaten van het eerste onderzoek worden aangevuld door onderzoek bij een tweede diersoort. In dit geval kan een standaard-testmethode worden gebruikt of kan de methode worden aangepast voor een kleiner aantal proefdieren.

De toxiciteitstest door herhaalde toediening (methoden B.7, B.8 en B.9) omvat de evaluatie van toxische effecten die het gevolg zijn van herhaalde blootstelling. Van groot belang is nauwkeurige klinische observatie van de proefdieren om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen. Door deze proeven moet het mogelijk worden om de toxicologische doelwitorganen alsmede de toxische en niet-toxische doses te bepalen. Verder gedetailleerd onderzoek van deze aspecten kan nodig zijn in onderzoek op langere termijn (methoden B.26-B.30 en B.33).

B.II Mutageniteit - Genotoxiciteit Mutageniteit heeft betrekking op het veroorzaken van permanente erfelijke veranderingen in de hoeveelheid of de structuur van het erfelijk materiaal van cellen of organismen. Deze veranderingen (mutaties) kunnen een enkel gen of gensegment, een genenblok of één of meer volledige chromosomen betreffen. De chromosomale effecten kunnen van structurele en/of numerieke aard zijn.

De mutagene activiteit van een stof wordt in vitro vastgesteld voor puntmutaties bij bacteriën (methoden B.13/14) en/of voor structurele chromosoomafwijkingen bij zoogdiercellen (methode B.10).

Ook in vivo procedures, zoals de micronucleustest (methode B.12) of de metafaseanalyse bij beenmergcellen (methode B.11) zijn aanvaardbaar.

Bij afwezigheid van contra-indicaties hebben de in vitro methoden echter verre de voorkeur.

Voor hogere produktievolumes en/of met het oog op de uitvoering of nadere uitwerking van een risicobeoordeling, kunnen aanvullende onderzoeken van de mutageniteit en pre-screening op carcinogeniteit nodig zijn. Deze kunnen voor een aantal doelen worden gebruikt : om resultaten van de basistests te bevestigen, om parameters te evalueren die niet in de basistests zijn onderzocht en om in vivo onderzoek op te zetten of uit te breiden.

Hiertoe omvatten de methoden B.15 tot B.25 zowel in vivo als in vitro eukaryotische systemen en een uitgebreide reeks biologische parameters ("end-points"). Deze proeven geven informatie over puntmutaties en andere parameters in organismen die complexer zijn dan de bacteriën die in de basistests worden gebruikt.

Als een programma van verder mutageniteitsonderzoek wordt overwogen, moet de opzet in principe zodanig zijn dat relevante aanvullende informatie over de mogelijke mutagene en/of carcinogene eigenschappen van de stof wordt verkregen.

Welk onderzoek in een bepaald geval geschikt is hangt af van een groot aantal factoren zoals : de chemische en fysische eigenschappen van de stof, de resultaten van voorafgaand bacteriologisch en cytogenetisch onderzoek, het metabolisch profiel van de stof, de resultaten van andere toxiciteitsonderzoeken en de toepassingen van de stof voor zover deze bekend zijn. In het licht van de verscheidenheid van factoren die eventueel nader onderzoek verdienen, is het niet gewenst om ten aanzien van de aard van de uitgevoerde proeven strikte regels vast te stellen.

In KB van 13 november 1997 is een aantal algemene beginselen vastgelegd. Duidelijke teststrategieën kunnen worden gevonden in de technische leidraad met betrekking tot risicobepaling; die is echter flexibel en kan naar behoefte worden aangepast aan specifieke omstandigheden.

Hieronder zijn methoden voor verder onderzoek opgesomd op basis van het voornaamste genetische criterium.

Onderzoek op gen(punt)mutaties a) Vooruit- of terugmutatieonderzoek waarbij eukaryotische micro-organismen (Saccharomyces cerevisiae) worden gebruikt (methode B.15) b) In vitro onderzoek op vooruitmutaties bij zoogdiercellen (methode B.17) c) Bepaling van recessief-letale mutaties van geslachtsgebonden genen bij Drosophila melanogaster (methode B.20) d) In vivo bepaling van somatische mutaties, vlekkentest op muizen (methode B.24) Onderzoek op chromosoomafwijkingen a) In vivo cytogenetische tests op zoogdieren;in vivo metafaseanalyse van beenmergcellen kan worden overwogen als dit niet bij het eerste onderzoek is gedaan (methode B.11). Verder kan in vivo cytogenetisch onderzoek worden verricht op geslachtscellen (methode B.23) b) In vitro cytogenetische tests op zoogdiercellen als dit niet bij het eerste onderzoek is gedaan (methode B.10) c) Onderzoek op dominant-letale mutaties bij knaagdieren (methode B.22) d) Onderzoek op erfelijke translocaties bij muizen (methode B.25) Genotoxische effecten - effecten op DNA Genotoxiciteit, waaronder wordt verstaan de mogelijk schadelijke effecten op genetisch materiaal die niet direct geassocieerd zijn met mutageniteit, kan worden aangetoond als schade aan het DNA zonder directe tekenen van mutatie. De volgende methoden, die gebruik maken van eukaryotische micro-organismen of zoogdiercellen, kunnen voor dergelijk onderzoek worden gebruikt : a) Mitotische recombinatie bij Saccharomyces cerevisiae (methode B.16) b) DNA-beschadiging en -herstel - DNA-herstelsynthese - zoogdiercellen in vitro (methode B.18) c) Zusterchromatidenuitwisseling bij zoogdiercellen in vitro (methode B.19) Alternatieve methoden voor onderzoek naar mogelijke carcinogeniteit Er zijn transformatietests voor zoogdiercellen beschikbaar die het vermogen meten van een stof om in celculturen morfologische en gedragsveranderingen te veroorzaken die waarschijnlijk samenhangen met kwaardaardige veranderingen in vivo (methode B.21). Er kunnen verschillende celtypes en verschillende transformatiecriteria worden gebruikt.

Risicobeoordeling van erfelijke effecten bij zoogdieren Er bestaan methoden voor het meten van erfelijke effecten bij zoogdieren die worden veroorzaakt door gen(punt)mutaties, bij voorbeeld de specifieke-locustest bij muizen, voor het meten van geslachtscelmutaties bij de eerste generatie (niet in deze bijlage opgenomen), en voor chromosoomafwijkingen, bij voorbeeld de test op erfelijke translocatie bij muizen (methode B.25). Dergelijke methoden kunnen worden gebruikt bij het evalueren van het genetisch risico van een stof voor de mens. Gezien de complexiteit van deze onderzoeken en het zeer grote aantal benodigde proefdieren, zeker bij de specifieke-locustest, zijn echter goede redenen nodig om deze uit te voeren.

B.III Carcinogeniteit Chemische stoffen kunnen, afhankelijk van het veronderstelde werkingsmechanisme, worden getypeerd als wel- of niet-genotoxische carcinogenen.

Het onderzoek op mutageniteit/genotoxiciteit kan reeds informatie over het genotoxisch-carcinogene vermogen van een stof opleveren nog vóór een screening wordt uitgevoerd. Aanvullende informatie kan worden verkregen uit subchronische of chronische toxiciteitstest waarbij herhaalde doses worden toegediend. De toxiciteitstest met herhaalde toediening, methode B.7 en onderzoeken met langer herhaalde doses omvatten de bepaling van histopathologische veranderingen, bij voorbeeld hyperplasie in bepaalde weefsels, die een aanwijzing kunnen vormen. Deze onderzoeken en toxicologische gegevens kunnen bijdragen tot het identificeren van stoffen met mogelijke carcinogeniteit, waarna dit aspect eventueel grondiger moet worden onderzocht via een carcinogeniteitstest (methode B.32) of vaak ook een gecombineerd onderzoek op chronische toxiciteit en carcinogeniteit (methode B.33).

B.IV Reproduktietoxiciteit Reproduktietoxiciteit kan op verschillende manieren worden vastgesteld, bij voorbeeld door verslechtering van de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsfuncties of -capaciteit, "effecten op de vruchtbaarheid" genoemd. Dit laatste aspect omvat ook teratogeniteit en effecten die optreden tijdens de lactatie.

Bij onderzoek op teratogeniteit, als onderdeel van onderzoek op ontwikkelingstoxiciteit, is de onderzoekmethode (methode B.31) voornamelijk gericht op toediening via orale weg. Als alternatief kunnen ook andere wegen gekozen worden, afhankelijk van de fysische eigenschappen van de te onderzoeken teststof of de waarschijnlijke wijze van blootstelling bij de mens. In zulke gevallen moet de methode op een passende manier gewijzigd worden met inachtneming van de relevante elementen van de 28-daagse testmethode.

Als een voortplantings(vruchtbaarheids)onderzoek over drie generaties nodig is kan de beschreven methode voor voortplantingsonderzoek over twee generaties (methode B.35) tot drie generaties worden verlengd.

B.V Neurotoxiciteit Neurotoxiciteit kan op verschillende manieren worden vastgesteld, bij voorbeeld door functionele veranderingen en/of structurele en biochemische veranderingen in het centrale of het perifere zenuwstelsel. Een eerste indicatie van neurotoxiciteit kan worden verkregen uit onderzoek naar acute toxiciteit. De toxiciteitstest met herhaalde toediening (methode B.7) houdt ook het vaststellen van neurotoxicologische effecten in, en de nadruk moet worden gelegd op nauwkeurige klinische waarnemingen om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen. De methode moet het mogelijk maken om stoffen te identificeren die een neurotoxische werking kunnen hebben, waarna verder, diepgaand onderzoek naar dit aspect nodig kan zijn. Verder is het van belang om rekening te houden met de mogelijkheid dat stoffen een specifieke neurotoxische werking kunnen hebben die met ander toxiciteitsonderzoek niet ontdekt kan worden. Bij bepaalde organische fosforverbindingen is bij voorbeeld een vertraagde neurotoxische werking ontdekt die vastgesteld kan worden met de methoden B.37 en B.38 na enkelvoudige of herhaalde blootstelling.

B.VI Immunotoxiciteit Immunotoxiciteit kan op verschillende manieren worden vastgesteld, bij voorbeeld door immunosuppressie en/of verhoging van de gevoeligheid van het immuunsysteem welke hypersensitiviteit of geïnduceerde auto-immuniteit tot gevolg heeft. De toxiciteitstest met herhaalde toediening (methode B.7) houdt onder meer het vaststellen van immunotoxische effecten in. De methode moet het mogelijk maken stoffen te identificeren die een immunotoxische werking kunnen hebben, waarna verder, diepgaand onderzoek naar dit aspect nodig kan zijn.

B.VII Toxicokinetica Toxicokinetisch onderzoek is een ondersteuning bij de interpretatie en evaluatie van toxiciteitsgegevens. Dit onderzoek dient om licht te werpen op bepaalde aspecten van de toxiciteit van de onderzochte stoffen en de resultaten kunnen worden gebruikt bij het opzetten van voortgezet toxiciteitsonderzoek. Het is niet de bedoeling dat in alle gevallen alle parameters worden bepaald. Zelden zal de gehele reeks toxicokinetische onderzoeken (absorptie, excretie, distributie en metabolisme) nodig zijn. Bij bepaalde verbindingen kan een andere volgorde de voorkeur verdienen, of kan worden volstaan met een onderzoek waarbij één enkele dosis wordt toegediend (methode B.36).

Informatie over de chemische structuur (SAR) en fysisch-chemische eigenschappen kan ook een indicatie geven over de absorptiekarakteristieken langs de voorgestelde toedieningsweg en over de te verwachten metabolische reacties en de verdeling over de weefsels. Over de toxicokinetische parameters kan ook informatie beschikbaar zijn door voorafgaand toxiciteitsonderzoek en toxicokinetisch onderzoek.

C. KARAKTERISERING VAN DE TESTSTOF De samenstelling van de teststof, met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen, en de relevante fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de stabiliteit, moeten vóór de aanvang van ieder toxiciteitsonderzoek bekend zijn.

De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof leveren belangrijke informatie over de keuze van de manier van toedienen, de opzet van ieder afzonderlijk onderzoek en het hanteren en bewaren van de teststof.

Alvorens het onderzoek wordt aangevat, moet een analytische methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de teststof (zo mogelijk met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen) in het toedieningsmedium en in het biologisch materiaal ontwikkeld worden.

Alle gegevens met betrekking tot de identificatie, de fysisch-chemische eigenschappen, de zuiverheid en het gedrag van de teststof moeten in het onderzoeksrapport worden opgenomen.

D. VERZORGING VAN DE DIEREN Bij toxiciteitstests zijn een stringente bewaking van de levensomstandigheden en een goede verzorging van de dieren een eerste vereiste. i) Huisvesting De leefomstandigheden in de kamers of ruimten waar de proefdieren zijn ondergebracht, moeten geschikt zijn voor het soort proefdier.Voor ratten, muizen en cavia's is een kamertemperatuur van 22° C + 3° C en een relatieve luchtvochtigheid van 30-70 % geschikt; voor konijnen moet de temperatuur 20° C + 3° C en de relatieve luchtvochtigheid 30-70 % bedragen.

Sommige experimentele technieken zijn bijzonder gevoelig voor temperatuureffecten; in dergelijke gevallen wordt in de beschrijving van de onderzoekmethode nader ingegaan op de correcte proefomstandigheden. Bij ieder onderzoek naar toxische effecten moeten de temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd, opgetekend en in het eindverslag van de studie worden opgenomen.

Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met afwisselend twaalf uur licht - twaalf uur duisternis. Nadere gegevens over de verlichting moeten worden opgetekend en in het eindverslag worden opgenomen.

Tenzij anders bij de methode vermeld, worden de dieren hetzij afzonderlijk, hetzij in kleine groepen van hetzelfde geslacht gehuisvest. In het laatste geval mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest.

Het is belangrijk om in verslagen over dierproeven steeds te vermelden welk soort kooien is gebruikt en hoeveel dieren tijdens de blootstelling aan de chemische stof en tijdens latere waarnemingsperioden in iedere kooi waren gehuisvest. ii) Voeding Bij de samenstelling van het voedsel moet worden voldaan aan alle eisen die de proefdiersoorten aan hun voeding stellen. Indien chemische stoffen via de voeding aan de dieren worden toegediend, kan de voedingswaarde door interactie tussen de stof en een bestanddeel van de voeding verminderd worden. Bij het interpreteren van de resultaten dient rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van dergelijke reacties. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk laboratoriumvoeder met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voedsel kan mede worden bepaald door de noodzaak de teststof, wanneer die via het voedsel wordt toegediend, op een passende wijze daarmee te vermengen.

Onzuiverheden in de voeding waarvan bekend is dat ze de toxiciteit beïnvloeden, mogen niet in werkzame concentraties voorkomen.

E. WELZIJN VAN DE DIEREN Bij het uitwerken van de testmethoden werd extra aandacht besteed aan dierenwelzijn. Enkele voorbeelden worden hieronder samengevat, maar deze lijst is niet volledig. De exacte formulering en/of voorwaarden dienen te worden nagelezen in de tekst van de methoden : - Voor de bepaling van de acute orale toxiciteit moeten twee alternatieve methoden, de "vaste-dosismethode" en de "bepaling van de acute-toxiciteitsklasse" worden overwogen. Bij de eerste methode wordt niet uitgegaan van de dood als specifiek criterium en bij deze methode worden minder proefdieren gebruikt. Bij de tweede methode wordt gemiddeld 70 % minder proefdieren gebruikt dan bij methode B.1 ter bepaling van de acute orale toxiciteit. Beide alternatieve methoden veroorzaken minder ongerief en pijn dan de klassieke methode. - Het aantal proefdieren is teruggebracht tot het wetenschappelijk aanvaardbare minimum : slechts vijf proefdieren van hetzelfde geslacht worden per dosisniveau getest voor de methoden B.1 en B.3; slechts tien dieren (en maar vijf voor de negatieve controlegroep) worden gebruikt voor de bepaling van de sensibilisering van de huid door de maximalisatietest voor cavia's (methode B.6); het aantal dieren dat benodigd is voor de positieve controle bij het testen van de mutageniteit in vivo wordt ook verminderd (methoden B.11 en B.12). - Ongerief en pijn van de dieren tijdens de proef worden tot een minimum teruggebracht; het kan nodig zijn dieren die ernstige, blijvende verschijnselen van lijden en pijn vertonen op humane wijze af te maken; het doseren van teststoffen volgens een methode waarvan bekend is dat zij veel lijden en pijn veroorzaken wegens de corrosieve of irriterende eigenschappen van de stof, is niet vereist (methoden B.1, B.2 en B.3). - Het testen met irrelevant hoge doses wordt vermeden door het invoeren van limietproeven, niet alleen bij de tests op acute toxiciteit (methoden B.1, B.2 en B.3) maar ook bij de in vivo tests op mutageniteit (methoden B.11 en B.12). - Een strategie voor irritatietests maakt het thans mogelijk een test achterwege te laten of de studie te beperken tot een enkel dier wanneer voldoende wetenschappelijke gegevens voorhanden zijn.

Deze wetenschappelijke gegevens kunnen worden gebaseerd op de fysisch-chemische eigenschappen van de stof, de resultaten van andere reeds uitgevoerde proeven of de resultaten van goed gevalideerde in vitro proeven. Indien bij voorbeeld bij het uitvoeren van een onderzoek naar acute toxiciteit bij toediening via de huid geen huidirritatie werd waargenomen bij de limietdosis van de te onderzoeken stof (methode B.3), kan verder testen op huidirritatie (methode B.4) overbodig zijn; stoffen die duidelijk bijtende of ernstige huidirriterende eigenschappen vertonen bij het onderzoek naar huidirritatie (methode B.4), dienen niet verder te worden getest op oogirritatie (methode B.5).

F. ALTERNATIEVE TESTEN Een wetenschappelijke doelstelling van de Europese Unie is het ontwikkelen en valideren van alternatieve technieken die dezelfde hoeveelheid informatie opleveren als de huidige dierproeven, maar waarbij minder proefdieren worden gebruikt, die minder lijden veroorzaken of die het gebruik van dieren volledig overbodig maken.

Naarmate dergelijke methoden ter beschikking komen, moet het gebruik ervan waar mogelijk worden overwogen voor de risicobeoordeling en de daaruit voortvloeiende classificatie en etikettering ten aanzien van de intrinsieke risico's.

G. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Bij de evaluatie en interpretatie van de testresultaten moet rekening worden gehouden met de beperkingen ten aanzien van de mate waarin de resultaten van dierproeven en in vitro tests kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens. Daarom kunnen aanwijzingen voor schadelijke effecten bij de mens, indien beschikbaar, gebruikt worden als bevestiging van de testresultaten.

Deze resultaten kunnen worden gebruikt voor de classificatie en etikettering van nieuwe en bestaande chemische stoffen met betrekking tot hun effecten op de menselijke gezondheid op basis van de intrinsieke eigenschappen die met deze methoden geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. De criteria voor classificatie en etikettering in de desbetreffende bijlage IV hebben mede betrekking op de "end-points" van de testprotocollen die bij deze testmethoden horen.

Deze resultaten kunnen ook worden gebruikt voor onderzoek gericht op de risicobeoordeling van nieuwe en bestaande chemische stoffen. De voor deze doeleinden gepaste teststrategieën zijn aangegeven in de desbetreffende documenten met richtsnoeren.

H. LITERATUUR De meeste van deze methoden zijn ontwikkeld binnen het kader van het OESO-programma inzake richtsnoeren voor het testen; zij moeten worden toegepast overeenkomstig de beginselen van "goede laboratoriumpraktijken", om zoveel mogelijk te komen tot "onderlinge acceptatie van gegevens".

Verdere informatie kan worden gevonden in de referenties die te vinden zijn in de OESO-richtsnoeren en in relevante literatuur die elders is gepubliceerd. » Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS

Bijlage II B "B.1ter ACUTE ORALE TOXICITEIT - METHODE TER BEPALING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE 1. METHODE 1.1. Inleiding De methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse geeft informatie ten behoeve van zowel risicobeoordeling als risicoclassificatie.

Bij de methode worden drie vaste doses gebruikt die voldoende ver uit elkaar liggen om een stof in te kunnen delen met behulp van de resultaten van het onderzoek. Verder kunnen in de door deze testmethode beschreven procedure nog drie aanvullende vaste doses gekozen worden die gebruikt kunnen worden als alternatieve opties op gegeven beslispunten of als opties voor verdere proeven. Het gebruik van (een of meer) aanvullende doses kan overwogen worden als een verdere verfijning wenselijk of noodzakelijk is.

Bij de methode wordt gebruik gemaakt van drie vastgestelde begindoses.

Het is niet de bedoeling om een exacte LD50 te berekenen maar om een blootstellingsbereik te bepalen waarbij mortaliteit kan worden verwacht, daar de dood van een aantal proefdieren nog steeds het hoofdcriterium van deze test is. De resultaten van deze test moeten volgens de criteria van bijlage IV geclassificeerd kunnen worden. Ten gevolge van de sequentiële aanpak kan de duur van de test langer zijn dan die van de in B.1 beschreven procedure. Het grote voordeel van deze methode is dat een kleiner aantal proefdieren nodig is dan in de acute-toxiciteitstest (oraal) (B.1) en de alternatieve vaste-dosismethode (B.1bis).

Zie ook de algemene inleiding deel B. 1.2. Definities Zie algemene inleiding deel B. 1.3. Principe van de testmethode De stof wordt in een van de vastgestelde doses oraal toegediend aan een groep proefdieren. De stof wordt getest met behulp van een getrapte procedure waarbij bij iedere stap drie dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Het is niet nodig om een voorstudie te doen.

Het al dan niet voorkomen van door de stof veroorzaakte mortaliteit bepaalt de volgende stap, d.w.z. : - verder testen is niet nodig - de volgende stap wordt uitgevoerd met dezelfde dosis, maar met dieren van het andere geslacht - de volgende stap wordt uitgevoerd met de eerstvolgende hogere of de eerstvolgende lagere dosis 1.4. Beschrijving van de testmethode 1.4.1. Voorbereiding Er wordt een aselecte steekproef samengesteld van gezonde jonge volwassen dieren. Deze worden gemerkt voor individuele herkenning en vóór het begin van de test ten minste vijf dagen in hun kooien gehouden ter acclimatisatie aan de laboratoriumomstandigheden. Dieren van hetzelfde geslacht die dezelfde dosis krijgen, mogen in één kooi worden ondergebracht maar het aantal dieren per kooi mag niet zo groot zijn dat duidelijke waarneming van ieder dier afzonderlijk belemmerd wordt.

De teststof wordt in een enkele dosis toegediend met behulp van een maagsonde of een geschikte intubatiecanule.

Zo nodig wordt de teststof in een geschikt vehiculum opgelost of gesuspendeerd. Het verdient aanbeveling om zo mogelijk gebruik te maken van een oplossing/suspensie in water. Als dat niet mogelijk is, kan naar olie (bij voorbeeld maïsolie) of in laatste instantie naar een ander vehiculum worden gegrepen. Van niet-waterige media moeten de toxicologische eigenschappen bekend zijn; als dat niet het geval is moeten deze eigenschappen vóór de test worden vastgesteld.

Voor het toedienen van de dosis dienen de proefdieren te vasten. Aan ratten wordt gedurende de voorafgaande nacht geen voedsel verstrekt, voor muizen geldt een periode van 3-4 uur. Water mag onbeperkt worden gegeven. 1.4.2. Proefomstandigheden 1.4.2.1. Proefdieren Tenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.

Bij het begin van de studie moet de gewichtsvariatie van de dieren minimaal zijn; het gewicht van ieder dier mag ten hoogste 20 % van het gemiddelde voor zijn geslacht afwijken. 1.4.2.2. Aantal en geslacht Voor iedere stap worden drie dieren van hetzelfde geslacht gebruikt.

Voor de eerste stap mag het geslacht vrij worden gekozen. 1.4.2.3. Dosisniveaus Het initiële dosisniveau wordt gekozen uit één van drie vaste dosisniveaus, bij voorbeeld 25, 200 en 2 000 mg/kg lichaamsgewicht. De begindosis moet zo zijn, dat waarschijnlijk bij ten minste een aantal van de blootgestelde proefdieren mortaliteit optreedt. Afhankelijk van de begindosis wordt één van de in bijlage 1 opgenomen stroomschema's gevolgd.

Bij het kiezen van het geslacht en de begindosis moet alle beschikbare informatie gebruikt worden, met inbegrip van die over relaties tussen structuur en activiteit. Als op grond van die informatie vermoed wordt dat waarschijnlijk bij het hoogste dosisniveau (2 000 mg/kg lichaamsgewicht) geen mortaliteit zal optreden, moet een limiettest uitgevoerd worden. Als over een teststof geen informatie beschikbaar is, wordt met het oog op het welzijn van de proefdieren een startdosis van 200 mg/kg lichaamsgewicht aanbevolen.

Soms kan het wenselijk zijn de informatie meer te verfijnen dan met het uitvoeren van de proef met drie vaste dosisniveaus van 25, 200 en 2 000 mg/kg lichaamsgewicht mogelijk zou zijn. In die gevallen kan overwogen worden om verder te testen met bijkomende vaste dosisniveaus van 5, 50 of 500 mg/kg lichaamsgewicht.

Doses waarvan bekend is dat zij hevige pijn en ongemak veroorzaken door bijtende of sterk irriterende werking, behoeven niet te worden toegediend.

Het tijdsinterval tussen de blootstelling van de opeenvolgende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de hevigheid van de toxische verschijnselen. Blootstelling van proefdieren van het andere geslacht, of blootstelling aan een volgende dosis moet worden uitgesteld totdat men zeker is van het overleven van de proefdieren die de vorige dosis toegediend hebben gekregen. 1.4.2.4. Limiettest Een limiettest met een dosisniveau van 2 000 mg/kg lichaamsgewicht kan worden uitgevoerd met drie proefdieren van elk geslacht. Als mortaliteit optreedt ten gevolge van de toediening van de teststof kan het nodig zijn om verder te testen met een dosis van 200 of 500 mg/kg lichaamsgewicht. 1.4.2.5. Observatieperiode De proefdieren moeten doorgaans 14 dagen worden geobserveerd, behalve wanneer dieren uit het onderzoek moeten worden verwijderd en op humane wijze worden afgemaakt uit welzijnsoverwegingen of omdat zij dood worden aangetroffen. De duur van deze observatieperiode moet echter niet streng vastgelegd worden. Deze moet worden bepaald door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel, en kan dus worden verlengd als dat nodig is. De tijdstippen waarop toxische verschijnselen merkbaar worden en weer verdwijnen zijn van belang, zeker als er een bepaalde tendens tot vertraagde toxiciteit wordt vastgesteld. Alle waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd, waarbij voor ieder dier een apart verslag wordt bijgehouden. 1.4.3. Procedure Na de periode van voedselonthouding moeten de dieren vóór de toediening van de teststof worden gewogen. Na toediening van de teststof kan nog gedurende 3-4 uur voedsel onthouden worden. Als een dosis in gedeelten over een langere tijd wordt toegediend kan het nodig zijn de dieren van voedsel en water te voorzien, afhankelijk van de duur van die periode.

Het maximale vloeistofvolume dat per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van de proefdieren. Bij knaagdieren mag het volume doorgaans niet meer dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht bedragen; in het geval van waterige oplossingen kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht aanvaardbaar zijn. Variaties in het testvolume moeten geminimaliseerd worden door het aanpassen van de concentratie zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Als een enkelvoudige dosis niet mogelijk is, kan de dosis gedurende een periode van minder dan 24 uur in kleinere gedeelten worden toegediend.

Bijzonderheden van de testprocedure worden beschreven in bijlage 1. 1.4.3.1. Algemene observaties Op de dag van de toediening moeten minimaal tweemaal - en eventueel vaker, als de reactie van de dieren op de behandeling dat nodig maakt - nauwkeurige klinische observaties worden verricht, en vervolgens minstens één keer daags. Dieren die stervende zijn of dieren die hevige pijn lijden of persistente tekenen van ernstige nood vertonen moeten op humane wijze worden afgemaakt. Dieren die om ethische redenen zijn afgemaakt worden beschouwd als dieren die door de teststof zijn gestorven.

Als dieren om ethische redenen worden gedood of dood worden aangetroffen, moet het tijdstip hiervan zo nauwkeurig mogelijk worden genoteerd. Wanneer de dieren aanhoudende verschijnselen van toxiciteit vertonen moeten aanvullende waarnemingen worden verricht. Onder meer moet gelet worden op veranderingen in huid en vacht, ogen en slijmvliezen en ook bij de ademhaling, de bloedsomloop en het autonome en centrale zenuwstelsel alsmede de somatomotorische activiteit en het gedrag. Er moet gelet worden op bevingen, stuiptrekkingen, kwijlen, diarree, lethargie, slaap en coma.

Alle waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd, waarbij voor ieder dier een apart rapport wordt bijgehouden. 1.4.3.2. Lichaamsgewicht Elk dier moet kort voor de teststof wordt toegediend worden gewogen en daarna ten minste eenmaal per week. Veranderingen in gewicht moeten worden berekend en bijgehouden. Bij de beëindiging van de test moeten de overlevende dieren worden gewogen alvorens ze op humane wijze worden afgemaakt. 1.4.3.3. Macroscopische necropsie Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of die uit de test worden verwijderd, moet een macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Alle macroscopische pathologische veranderingen moeten voor elk proefdier worden vastgelegd. Als organen van proefdieren die 24 uur of meer in leven zijn gebleven, macroscopische pathologische veranderingen vertonen kan ook microscopische necropsie worden overwogen omdat dat bruikbare informatie kan opleveren. 2. GEGEVENS Van ieder dier moeten individuele gegevens beschikbaar gemaakt worden. Verder moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen waarbij voor iedere testgroep wordt geregistreerd : het gebruikte aantal proefdieren, het aantal dat tekenen van toxiciteit heeft vertoond, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om ethische redenen is afgemaakt, het tijdstip van sterven van ieder dier, een beschrijving en het verloop in de tijd van de toxische effecten (inclusief de eventuele reversibiliteit daarvan), en de resultaten van de necropsie.

Algemene richtsnoeren voor de interpretatie van de resultaten met het oog op de classificatie worden gegeven in bijlage 2. 3. RAPPORTAGE Verslag van de proefnemingen In dit verslag dienen, voor zover mogelijk, de volgende gegevens te worden opgenomen : Proefdieren : - diersoort, stam; - microbiologische status van de dieren, indien bekend; - aantal, leeftijd en geslacht van de dieren; - herkomst, behuizing, voeding enz.; - het gewicht van elk dier afzonderlijk bij de aanvang van de test, wekelijks daarna en bij het einde van de test.

Proefomstandigheden : - motivering van de keuze van het vehiculum als dit geen water is; - bijzonderheden over de toediening van de teststof met inbegrip van de toegediende volumes en het tijdstip van toediening; - bijzonderheden omtrent voedsel en water (met inbegrip van type en herkomst van het voedsel, waterbron); - motivering van de keuze van de begindosis.

Resultaten : - overzicht in tabelvorm van de gegevens met betrekking tot ieder dier, opgesplitst naar dosis en geslacht (het betreft de respons van de dieren die toxische verschijnselen, waaronder sterfte, vertoonden alsmede de aard, duur en hevigheid van de effecten); - tijdsverloop van de eerste verschijnselen van intoxicatie en eventuele reversibiliteit van deze verschijnselen voor ieder dier afzonderlijk; - resultaten van de necropsie en eventuele histopathologische bevindingen voor ieder dier afzonderlijk, indien beschikbaar.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies. 4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 423 van de OESO. BIJLAGE 1 TESTPROCEDURE 1. Zoals vermeld in punt 1.4.2.3 moet de begindosis zó worden gekozen dat ten minste een gedeelte van de proefdieren sterft. De ter zake relevante informatie omvat onder meer : - gegevens over fysisch-chemische eigenschappen; - relaties tussen structuur en activiteit; - alle gegevens van andere toxiciteitstesten, en - het verwachte gebruik van de teststof. 2. Voor iedere begindosis geeft het bijbehorende testschema dat in deze bijlage is opgenomen, de te volgen procedure.Afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze afgemaakte dieren volgt de testprocedure de aangegeven pijlen. 3. Indien bij een begindosis van 25 of 200 mg/kg lichaamsgewicht slechts één dier van het tweede geslacht sterft, leidt dit gewoonlijk tot niet verder testen.Als er echter geen toxische verschijnselen worden waargenomen bij de andere vijf dieren moet bij de autopsie aan de mogelijkheid gedacht worden dat de mortaliteit geen gevolg is van de teststof. In dat geval moet de test worden vervolgd met de eerstvolgende hogere dosis. 4. Indien bij een begindosis van 2000 mg/kg lichaamsgewicht slechts één dier per geslacht sterft is de verwachtingswaarde van de LD50 meer dan 2000 mg/kg lichaamsgewicht.Omdat dit echter een grensgeval is moet de respons van de andere twee dieren per geslacht nauwkeurig worden onderzocht. Het optreden van duidelijke toxische verschijnselen bij deze dieren kan aanleiding zijn tot een classificatie die overeenkomt met een LD50-waarde van 2000 mg/kg lichaamsgewicht of minder, of tot verder testen op hetzelfde niveau. 5. De procedure kan het verder testen op drie vaste dosisniveaus inhouden (optie 2).Deze optie kan worden gebruikt voor het kiezen van een alternatieve dosis op een gegeven beslispunt, of voor verder testen nadat de lopende test is afgesloten (optie 1). Bij optie 1 is de testprocedure aangegeven met vette pijlen, bij optie 2 met dunne pijlen.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS

Bijlage II C "B.6 SENSIBILISATIE VAN DE HUID 1. METHODE 1.1. Inleiding Opmerkingen : De gevoeligheid en het vermogen van een test om stoffen op te sporen met potentieel huidsensibiliserende eigenschappen bij de mens zijn belangrijk in een systeem voor de classificatie van toxische stoffen ten behoeve van de volksgezondheid.

Er bestaat géén universele testmethode waarmee alle stoffen die de menselijke huid kunnen sensibiliseren, adequaat kunnen worden geïdentificeerd en die voor alle stoffen toepasbaar is.

Bij de keuze van een test moet rekening worden gehouden met factoren zoals de fysische kenmerken van een stof, met inbegrip van het vermogen om de huid binnen te dringen.

Er zijn twee soorten tests ontwikkeld die gebruik maken van cavia's : het type waarbij een adjuvans wordt gebruikt en waarbij een verhoogde allergische reactie wordt opgewekt door het oplossen of suspenderen van de teststof in Freunds compleet adjuvans (FCA), en tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt.

Proeven met adjuvans voorspellen een eventueel huidsensibiliserend effect van een stof bij mensen wellicht nauwkeuriger dan methoden die geen gebruik maken van Freunds compleet adjuvans; zij verdienen dan ook de voorkeur.

De maximalisatietest met cavia's is een algemeen toegepaste test waarbij een adjuvans gebruikt wordt. Alhoewel verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om het huidsensibiliserend vermogen van een stof aan te tonen, wordt de maximalisatietest beschouwd als de adjuvanstechniek die de voorkeur heeft.

Voor veel soorten chemicaliën worden tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt (de Buehlertest heeft de voorkeur) als minder gevoelig beschouwd.

In bepaalde gevallen kunnen er goede redenen zijn om de Buehlertest te verkiezen, met lokale applicatie in plaats van intradermale injectie zoals in de maximalisatietest met cavia's. Voor het gebruik van de Buehlertest dient een wetenschappelijke motivering te worden gegeven.

De maximalisatietest met cavia's en de Buehlertest worden hier beschreven. Andere methoden mogen worden gebruikt op voorwaarde dat zij goed zijn gevalideerd en wetenschappelijk verantwoord zijn.

Indien een erkende screeningtest werd uitgevoerd en daarbij een positief resultaat werd geconstateerd, mag de teststof als een potentieel sensibiliserende stof worden aangemerkt en is het niet nodig ook nog een test met cavia's uit te voeren. Indien een dergelijke test evenwel tot een negatief resultaat heeft geleid, moet een caviatest worden uitgevoerd overeenkomstig de onder deze testmethode beschreven procedure.

Zie ook algemene inleiding deel B. 1.2. Definities Huidsensibilisatie (allergische contactdermatitis) : is een door een immuunrespons veroorzaakte huidreactie op een stof. Bij mensen kan de reactie de vorm aannemen van jeuk, erytheem, oedeem (waterzucht), pukkels, blaasjes, blaren of een combinatie hiervan. Bij andere soorten kunnen de reacties anders zijn en kan alleen erytheem of oedeem optreden.

Inductieblootstelling : een experimentele blootstelling van een proefdier aan een teststof met de bedoeling een hypersensitieve toestand te induceren.

Inductieperiode : een periode van ten minste een week na de inductieblootstelling, gedurende welke een hypersensitieve toestand ontwikkeld kan worden.

Provocatieblootstelling : een experimentele blootstelling - na de inductieperiode - van een voorheen reeds blootgesteld proefdier aan een teststof, om vast te stellen of het dier een hypersensitieve reactie vertoont. 1.3. Referentiestoffen De gevoeligheid en de betrouwbaarheid van de gebruikte technieken moet iedere zes maanden worden vastgesteld door het gebruik van stoffen waarvan bekend is dat ze lichte tot matige huidsensibiliserende eigenschappen hebben.

Bij een goed uitgevoerde test kan een reactie van ten minste 30 % worden verwacht bij een adjuvanstest en van ten minste 15 % bij een niet-adjuvanstest, bij gebruikmaking van zwakke/middelsterke sensibilisatoren.

De volgende stoffen genieten de voorkeur : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Er kunnen omstandigheden zijn waarbij andere referentiestoffen, die aan bovenstaande eisen voldoen, kunnen worden gebruikt; dit moet wetenschappelijk verantwoord worden. 1.4. Principe van de testmethode De proefdieren worden eerst aan de teststof blootgesteld door een intradermale injectie en/of epidermale toepassing (inductieblootstelling). Na een rustperiode van 10 tot 14 dagen (inductieperiode), tijdens welke een immuunreactie op gang kan komen, worden de dieren blootgesteld aan een provocatiedosis. De omvang en intensiteit van de cutane reactie op de provocatieblootstelling bij de proefdieren wordt vergeleken met die van de controlegroep die een blanco behandeling ondergaat bij de industrie maar wél de provocatiedosis toegediend krijgt. 1.5. Beschrijving van de testmethoden Als het nodig wordt geacht om de teststof te verwijderen, moet dit gebeuren met behulp van water of een ander geschikt oplosmiddel zonder dat de optredende reactie daardoor wordt beïnvloed of de opperhuid daardoor wordt geschonden. 1.5.1. Maximalisatietest met cavia's (GPMT) 1.5.1.1. Voorbereiding Gezonde jonge volwassen albino cavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het einde van de test. 1.5.1.2. Proefomstandigheden 1.5.1.2.1. Proefdieren Er wordt gebruik gemaakt van stammen albino cavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. 1.5.1.2.2. Aantal en geslacht Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren.

Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.

Minimaal 10 dieren worden gebruikt voor de behandelde groep en ten minste vijf voor de controlegroep. Als er minder dan 20 testcavia's en 10 controlecavia's worden gebruikt en het niet mogelijk is om vast te stellen of de teststof sensibiliserende eigenschappen heeft, wordt ten sterkste aangeraden om meer dieren te testen zodat een totaal van ten minste 20 testdieren en 10 controledieren wordt bereikt. 1.5.1.2.3. Dosisniveaus De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet systemisch goed te verdragen zijn en gelijk zijn aan de hoogste concentratie die lichte tot matige huidirritatie veroorzaakt.

De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren. Hierbij kan worden overwogen gebruik te maken van met FCA behandelde proefdieren. 1.5.1.3. Procedure 1.5.1.3.1. Inductie Dag 0 - Testgroep In de onthaarde schouderstreek worden drie paar injecties van 0,1 ml gegeven, zó dat van ieder paar er één aan elke zijde ligt : Injectie 1 : een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing;

Injectie 2 : de teststof in een geschikt vehiculum en in de geschikte concentratie;

Injectie 3 : de teststof in de gekozen concentratie, opgelost in een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing.

Voor injectie 3 worden de in water oplosbare teststoffen in water opgelost vóór het mengen met FCA. In vet oplosbare of onoplosbare stoffen worden in FCA gesuspendeerd vóór het mengen met water. De uiteindelijke concentratie van de teststof moet gelijk zijn aan die welke voor injectie 2 wordt gebruikt.

De injecties 1 en 2 worden dicht bij elkaar en het dichtst bij het hoofd toegediend en injectie 3 aan de staartzijde van het testgebied.

Dag 0 - Controlegroep Op dezelfde plaatsen als bij de proefdieren worden drie paar intradermale injecties van 0,1 ml toegediend : Injectie 1 : een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing;

Injectie 2 : het onverdunde vehiculum;

Injectie 3 : een 50 %-formulering (gewicht/volume) van het vehiculum in een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing.

Dag 5-7 - Testgroep en controlegroep Als de te onderzoeken stof geen huidiritatie geeft wordt het testgebied ongeveer 24 uur vóór de plaatselijke inductiebehandeling na knippen en/of scheren behandeld met 0,5 ml van een 10 %-formulering van natriumlaurylsulfaat in vaseline om een plaatselijke irritatie op te wekken.

Dag 6-8 - Testgroep Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Een filtreerpapier (2 cm x 4 cm) wordt gedrenkt met de teststof in een geschikt vehiculum en door middel van een occlusief verband gedurende 48 uur op het testgebied aangebracht. De keuze van het vehiculum moet worden verantwoord. Vaste stoffen worden verpulverd en in een geschikt vehiculum opgenomen.

Vloeistoffen kunnen, zo nodig, onverdund worden aangebracht.

Dag 6-8 - Controlegroep Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt alleen het vehiculum aangebracht en gedurende 48 uur met het testgebied in contact gehouden door een occlusief verband. 1.5.1.3.2. Provocatie Dag 20-22 - Testgroep en controlegroep Beide flanken van de dieren uit de testgroep en de controlegroep worden onthaard. Op één flank van de behandelde dieren wordt een gaasje of cupje met de teststof aangebracht en, waar nodig, een gaasje of cupje met alleen het vehiculum op de andere flank. Door middel van een occlusief verband wordt het gaasje gedurende 24 uur met de huid in contact gehouden. 1.5.1.3.3. Observatie en scoring : testgroep en controlegroep - Ongeveer 21 uur nadat het gaasje is verwijderd, wordt het provocatiegebied gereinigd en zo nodig zorgvuldig geknipt en/of geschoren en onthaard. - Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 48 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores. - Ongeveer 24 uur na deze waarneming wordt een tweede waarneming gedaan (72 uur na aanvang provocatie) en eveneens geregistreerd.

Aangeraden wordt om de proefdieren en controledieren "blind" (d.w.z. zonder te weten of het test- of controledieren betreft) te scoren.

Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) worden overwogen met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep.

Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de scoreschaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties. 1.5.2. Buehlertest 1.5.2.1. Voorbereiding Gezonde jonge volwassen albino cavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het eind van de test. 1.5.2.2. Proefomstandigheden 1.5.2.2.1. Proefdieren Er wordt gebruik gemaakt van stammen albino cavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. 1.5.2.2.2. Aantal en geslacht Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren.

Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.

Voor de behandelde groep worden minimaal 20 dieren gebruikt en voor de controlegroep ten minste 10. 1.5.2.2.3. Dosisniveaus De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet de hoogste zijn die lichte maar geen excessieve huidirritatie geeft. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren.

Als de teststoffen in water oplosbaar zijn verdient water of een verdunde, niet-irriterende oplossing van een surfactans de voorkeur als vehiculum. Bij andere teststoffen wordt de voorkeur gegeven aan 80 % alcohol/water bij de inductie en aan aceton bij de provocatie. 1.5.2.3. Procedure 1.5.2.3.1. Inductie Dag 0 - Testgroep Eén flank wordt onthaard. Het testgaasje moet doordrenkt zijn met de teststof in een geschikt vehiculum (de keuze van het vehiculum moet worden verantwoord; vloeibare teststoffen kunnen eventueel onverdund worden aangebracht). Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband.

Het testgaasje moet afdekkend zijn. Er kan gebruik worden gemaakt van een rond of vierkant wattenschijfje met een oppervlakte van ongeveer 4-6 cm2. Om een goede afdekking te garanderen kan een passende voorziening worden gebruikt waardoor de bewegingsvrijheid van de dieren wordt beperkt. Bij gebruik van een zwachtel alléén kan herhaalde blootstelling nodig zijn.

Dag 0 - Controlegroep Een flank wordt onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt nu alleen het vehiculum aangebracht. Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband. Als kan worden aangetoond dat een blanco controlegroep niet nodig is, kunnen niet-behandelde dieren als controlegroep worden gebruikt.

Dag 6-8 en 13-15 - Testgroep en controlegroep Hetzelfde testoppervlak van dezelfde flank ondergaat, na eventuele verwijdering van de beharing, op dag 6-8 en nogmaals op dag 13-15 dezelfde blootstelling als op dag 0. 1.5.2.3.2. Provocatie Dag 27-29 - Testgroep en controlegroep De onbehandelde flank van de test- en controledieren wordt onthaard.

Een occlusieve pleister of een cupje met de juiste hoeveelheid teststof in de maximale niet-irriterende concentratie, wordt aangebracht op het achterste deel van de flank van de testdieren en van de controledieren.

Indien dit wenselijk is wordt op het voorste gedeelte van de onbehandelde flank van zowel de testdieren als de controledieren een occlusieve pleister of een cupje met alleen het vehiculum aangebracht.

De pleisters of cupjes worden gedurende 6 uur op hun plaats gehouden door een geschikt verband. 1.5.2.3.3. Observatie en scoring - Ongeveer 21 uur nadat de pleister is verwijderd wordt het provocatiegebied onthaard. - Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 30 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores. - Ongeveer 24 uur na de 30-uurswaarneming wordt een tweede waarneming van de huidreacties gedaan (ongeveer 54 uur na aanvang van de provocatie) en worden de resultaten weer geregistreerd.

Aangeraden wordt om de testdieren en controledieren "blind" (d.w.z. zonder te weten of het test- of controledieren betreft) te scoren.

Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) overwogen worden met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep.

Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de schaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties. 2. GEGEVENS (GPMT EN BUEHLERTEST) Alle gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat, waarbij voor ieder dier de bij iedere controle waargenomen huidreacties worden vermeld.3. RAPPORTAGE (GPMT EN BUEHLERTEST) Wanneer vóór de proef met cavia's een screeningstest wordt uitgevoerd, moet een beschrijving van of verwijzing naar de test in kwestie (bij voorbeeld de Local Lymph Node Assay (LLNA) of de Mouse Ear Swelling Test (MEST) worden gegeven en moeten bijzonderheden over de procedure worden verstrekt.Verder moeten de resultaten worden gerapporteerd die met de teststof en de referentiestof zijn verkregen.

Verslag van de proefnemingen (GPMT en Buehlertest) In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen : Proefdieren : - gebruikte caviastam; - aantal, leeftijd en geslacht van de dieren; - herkomst, behuizing, dieet, enz.; - gewicht van ieder dier bij het begin van de proefneming.

Proefomstandigheden : - gebruikte techniek bij het prepareren van het te behandelen oppervlak; - bijzonderheden met betrekking tot het pleister- of gaasmateriaal en de wijze van aanbrengen; - resultaten van de voorstudie met conclusies over de inductie- en provocatieconcentraties die bij de test moeten worden gebruikt; - bijzonderheden over de bereiding van de teststof, het toedienen en het verwijderen hiervan; - motivering van de keuze van het vehiculum; - concentraties van vehiculum en teststof die gebruikt zijn bij de inductie en de provocatie en de totale hoeveelheid teststof die gebruikt is voor inductie en provocatie.

Resultaten : - een samenvatting van de resultaten van de meest recente gevoeligheids- en betrouwbaarheidscontrole (zie 1.3), met inbegrip van informatie over gebruikte teststof, concentratie en vehiculum; - resultaten voor ieder dier afzonderlijk, inclusief scores; - beschrijving van de aard en de intensiteit van de waargenomen effecten; - eventuele histopathologische bevindingen.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies. 4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 406 van de OESO Aanhangsel TABEL : Magnusson/Kligman-scoreschaal voor de evaluatie van reacties op de provocatiepleister 0 = geen zichtbare verandering 1 = discontinu of vlekkerig erytheem 2 = matig en aaneengesloten erytheem 3 = ernstig erytheem met zwelling" Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998. ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS

Bijlage II D "B.7 TOXICITEIT (ORAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN) 1. METHODE 1.1 Inleiding Zie algemene inleiding deel B 1.2. Definities Zie algemene inleiding deel B 1.3. Principe van de testmethode De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal-toegediend aan verschillende groepen proefdieren, in trapsgewijs stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden afgemaakt, wordt een necropsie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn worden afgemaakt en ook hierop wordt een necropsie verricht.

Bij deze methode ligt het accent meer op neurologische effecten als specifiek eindpunt. Benadrukt moet worden dat het noodzakelijk is de dieren zorgvuldig klinisch te observeren om zoveel mogelijk informatie te verzamelen. Deze methode moet het mogelijk maken potentieel neurotoxische chemicaliën te identificeren, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzocht. Voorts kan deze methode aanwijzingen geven over immunologische effecten en toxiciteit voor de voortplantingsorganen. 1.4. Beschrijving van de testmethode 1.4.1. Voorbereidingen Gezonde jonge volwassen dieren worden op aselecte wijze verdeeld over de controlegroep en de testgroepen. De kooien moeten op zodanige wijze worden opgesteld dat eventuele plaatseffecten geminimaliseerd worden.

De dieren worden individueel geïdentificeerd en worden vóór het onderzoek ten minste 5 dagen in hun kooi gehouden ter acclimatisatie aan de laboratoriumomstandigheden.

De teststof wordt toegediend via een maagsonde of via de voeding of het drinkwater. De wijze van toedienen is afhankelijk van het doel van het onderzoek en de fysisch/chemische eigenschappen van de teststof.

Zo nodig moet de teststof worden opgelost of gesuspendeerd in een geschikt vehiculum. Het verdient aanbeveling om zo mogelijk een waterige oplossing of suspensie te gebruiken. Als dit niet mogelijk is kan voor een oplossing of suspensie in olie (bij voorbeeld maïsolie) of in laatste instantie voor een oplossing in een ander medium worden gekozen. Van andere media dan water moeten de toxicologische karakteristieken bekend zijn. De stabiliteit van de teststof in het vehiculum moet worden vastgesteld. 1.4.2. Proefomstandigheden 1.4.2.1. Proefdieren De voorkeur wordt gegeven aan ratten, hoewel andere knaagdiersoorten kunnen worden gebruikt. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde volwassen dieren van rattenstammen die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. De toediening moet zo snel mogelijk na het verspenen beginnen en in ieder geval vóór de dieren negen weken oud zijn.

Bij het begin van de studie moet de gewichtsvariatie van de dieren minimaal zijn en mag het gewicht van ieder dier niet meer dan 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht.

Als een proef met herhaalde orale toediening wordt uitgevoerd als inleiding op een studie van langere duur, moeten de dieren in beide studies bij voorkeur tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben. 1.4.2.2. Aantal en geslacht Op ieder dosisniveau moeten ten minste 10 dieren (5 mannetjes en 5 wijfjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is sommige dieren tussentijds te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met het aantal dat volgens de proefopzet tussentijds zal worden gedood.

Daarnaast kan een satellietgroep van 10 dieren (5 per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau en vervolgens gedurende 14 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van 10 controledieren (5 per geslacht) gebruikt. 1.4.2.3. Dosisniveaus In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist.

Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren van de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als de dieren in de testgroep. Indien een vehiculum wordt gebruikt bij het toedienen van de teststof moet de controlegroep het grootste gebruikte volume van dat vehiculum toegediend krijgen.

Als uit andere gegevens kan worden geconcludeerd dat bij een dagelijkse dosis van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht geen effecten worden verwacht, kan een limiettest worden uitgevoerd. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een studie worden uitgevoerd om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen.

De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Het hoogste dosisniveau moet zó gekozen worden dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden.

Verder moet een dalende reeks doses worden gekozen met het oog op het vaststellen van een eventuele dosis-responsrelatie en het niveau zonder schadelijk effect (NOAEL) op het laagste dosisniveau.

Dosisniveaus die telkens een factor 2 à 4 verschillen zijn vaak optimaal. Toevoeging van een vierde testgroep is vaak te prefereren boven een zeer groot niveauverschil (bij voorbeeld een factor 10 of meer) tussen de opvolgende doses.

Indien de stoffen via de voeding of het drinkwater worden toegediend is het van belang erop te letten dat de betrokken hoeveelheden teststof de normale voedings- of waterbalans niet verstoren. Als de teststof via de voeding wordt toegediend kan een vaste concentratie in de voeding (ppm) worden gebruikt of een constant dosisniveau in termen van het lichaamsgewicht van het dier. Aangegeven moet worden welk alternatief is gebruikt. Bij gebruik van een maagsonde voor het toedienen van de teststof moet de dosis iedere dag op hetzelfde tijdstip worden gegeven en zo nodig worden aangepast om een constant dosisniveau per kg lichaamsgewicht te handhaven.

Als een studie met herhaalde toediening wordt gebruikt als voorloper van een studie op lange termijn moet bij beide studies soortgelijk voedsel worden verstrekt. 1.4.2.4. Limiettest Als volgens de hier beschreven procedures een proef wordt uitgevoerd met een dosisniveau van ten minste 1000 mg/kg lichaamsgewicht per dag - of, in het geval van toediening via het voedsel of het drinkwater, het equivalente percentage in het voedsel of het water (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht) - en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige proef met drie dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing tenzij het niveau waarop de mens kan worden blootgesteld, testen met een hogere dosis noodzakelijk maakt. 1.4.2.5. Observatieperiode De dieren moeten 28 dagen worden geobserveerd. Dieren uit een satellietgroep die bestemd is voor vervolgwaarnemingen moeten daarna nog ten minste 14 dagen zonder behandeling worden geobserveerd om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen. 1.4.3. Procedure De dieren krijgen de teststof gedurende 28 dagen zeven maal per week toegediend. Indien de teststof vijf maal per week wordt toegediend moet dit worden verantwoord. Als de teststof wordt toegediend via een maagsonde, moet dit in één keer gebeuren onder gebruikmaking van een maagcatheter of een geschikte intubatiecanule. De maximale hoeveelheid vloeistof die per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van het dier. Het volume mag niet meer zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve als er een waterige oplossing wordt gebruikt, in welk geval 2 ml/100 g lichaamsgewicht is toegestaan. Met uitzondering van irriterende of bijtende stoffen, die gewoonlijk heviger effecten veroorzaken bij hogere concentraties, moet de variabiliteit van het testvolume worden geminimaliseerd door aanpassing van de concentratie, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante testvolume wordt gebruikt. 1.4.3.1. Algemene observaties Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met in achtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. Stervende dieren en dieren die in grote nood verkeren of hevige pijn lijden moeten worden verwijderd, op humane wijze afgemaakt en aan een necropsie onderworpen.

Alle dieren worden éénmaal voor het begin van de proef nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip uitgevoerd worden. De resultaten moeten zorgvuldig worden geregistreerd, waarbij bij voorkeur gebruik wordt gemaakt van scoringsystemen die expliciet door het testlaboratorium zijn vastgelegd. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de proefomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen) : veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Veranderingen in gang, houding en respons op vasthouden en ook het uitvoeren van clonische of tonische bewegingen, stereotypen (bij voorbeeld excessief poetsgedrag, ronddraaien) of afwijkend gedrag (bij voorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden geregistreerd.

Gedurende de vierde week van de blootstelling moet de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (auditief, visueel en proprioceptief) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht en de motorische activiteit plaatsvinden. Nadere bijzonderheden omtrent de te volgen procedures zijn te vinden in de literatuur (zie algemene inleiding deel B).

Als de studie wordt verricht als voorstudie op een daaropvolgende subchronische (90-daagse) studie, kunnen functionele observaties in de vierde week achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele observaties in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden.

Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele prestaties uit de studie met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor de daaropvolgende subchronische studie ten goede kan komen.

Bij wijze van uitzondering kunnen functionele observaties ook achterwege blijven bij groepen die verder dermate sterke toxiciteitseffecten vertonen dat het testen van de functionele prestaties daardoor ernstig wordt gehinderd. 1.4.3.2. Lichaamsgewicht en voedsel/waterconsumptie Ieder dier moet ten minste eenmaal per week worden gewogen. De opgenomen hoeveelheid voedsel en water moet minstens eenmaal per week worden gemeten. Indien de teststof via het drinkwater wordt toegediend moet de waterconsumptie ook minstens eenmaal per week worden gemeten. 1.4.3.3. Hematologie Aan het eind van de testperiode moeten de volgende onderzoeken worden verricht : bepaling van de hematocriet en de hemoglobineconcentratie, erythrocytentelling, totale en differentiële leukocytentelling, plaatjestelling en bepaling van de stollingstijd en het stollingsvermogen.

De bloedmonsters worden genomen net vóór of tijdens het afmaken van de dieren; er dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard. 1.4.3.4. Klinische biochemie Om belangrijke toxische effecten op de weefsels en met name op de nieren en de lever te onderzoeken, moet klinisch-biochemisch onderzoek verricht worden op bloedmonsters van alle dieren, met uitzondering van de dieren die stervend zijn aangetroffen of die voortijdig zijn afgemaakt. Deze monsters moeten juist vóór het afmaken of als onderdeel van de procedure hiervoor worden genomen. Het verdient aanbeveling om de dieren vóór het bloedafnemen een nacht te laten vasten (1). Onderzoek van plasma en serum moet omvatten : natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albumine, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase, alkalische fosfatase, gamma- glutamyltranspeptidase en sorbitoldehydrogenase). Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en galzuren kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven.

De volgende facultatieve urineanalysebepalingen kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek worden uitgevoerd op basis van een volgens een vast tijdschema verlopende urinemonsterneming : aspect, hoeveelheid, osmolaliteit of dichtheid, pH, proteïnen, glucose en bloed/bloedcellen.

Verder moet een onderzoek naar serummarkers van algemene weefselschade overwogen worden. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn : calcium, fosfaat, triglyceriden (nuchterwaarde), specifieke hormonen, methemoglobine en cholesterinase. Deze moeten in het geval van teststoffen uit bepaalde klassen c.q. van geval tot geval worden geïdentificeerd.

In het algemeen is een flexibele aanpak noodzakelijk, afhankelijk van het soort proefdieren en het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.

Als bij gebrek aan referentiegegevens geen adequate vergelijkingsbasis voorhanden is, moet worden overwogen om hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen vóór met de toediening wordt begonnen. 1.4.3.5. Macroscopische necropsie Alle proefdieren uit het onderzoek moeten worden onderworpen aan een volledige, gedetailleerde macroscopische necropsie, die onder meer een zorgvuldig onderzoek van het uitwendig oppervlak van het lichaam, alle lichaamsopeningen en de hersen-, borst- en buikholte en de organen daarin omvat. De lever, nieren, bijnieren, testes, bijballen, zwezerik, milt, hersenen en het hart van alle dieren moeten worden ontdaan van alle aanhangend weefsel en zo snel mogelijk na dissectie in natte toestand worden gewogen om uitdroging te voorkomen.

De volgende weefsels moeten worden geconserveerd in het fixeermiddel dat zowel voor het type weefsel als het voorgenomen histopathologische onderzoek het meest geschikt is : alle grotere laesies, hersenen (representatieve delen waaronder de grote en kleine hersenen en de brug van Varol), ruggemerg, maag, dunne en dikke darm met plaques van Peyer, lever, nieren, bijnieren, milt, hart, zwezerik, schildklier, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren, secundaire geslachtsorganen (bij voorbeeld uterus, prostaat), urineblaas, lymfeklieren (bij voorkeur een klier die in de route van de toediening gelegen is en één die daar ver van verwijderd is, om rekening te houden met systemische effecten), perifere zenuwen (grote heupzenuw of scheenbeenzenuw), bij voorkeur dicht bij de spier, en een coupe van het beenmerg (of, in plaats daarvan, een direct op een objectglaasje aangebracht stukje opgezogen beenmerg). De resultaten van het klinische onderzoek en van andere onderzoeken kunnen aanleiding zijn om nog andere weefsels te bestuderen. Ook moeten alle andere organen worden, geconserveerd die, voor zover bekend is van de eigenschappen van de teststof, waarschijnlijk als doelorgaan fungeren. 1.4.3.6. Histopathologisch onderzoek Bij de dieren in de met de hoogste dosisniveau behandelde groep en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de geconserveerde organen en weefsels.

Als met de behandeling samenhangende veranderingen worden geconstateerd in de groep met de hoogste dosering, moet het onderzoek worden uitgebreid tot de dieren van alle andere doseringsgroepen.

Alle grotere laesies moeten worden onderzocht.

Indien gebruik wordt gemaakt van een satellietgroep moet ook daarbij histopathologisch onderzoek worden verricht op alle organen die in de behandelde groep effecten vertonen. 2. GEGEVENS Er moeten individuele gegevens worden verstrekt.Verder moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere proefgroep laten zien : het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om ethische redenen is afgemaakt en het tijdstip waarop, het aantal dat verschijnselen van toxiciteit vertoonde, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen, waaronder het tijdstip van aanvang, de duur en ernst van de verschijnselen, het aantal dieren dat laesies vertoonde, het soort laesie en het percentage dieren dat elk soort laesie vertoonde.

Zo mogelijk moeten de numerieke resultaten met behulp van een geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methode worden geëvalueerd. De gebruikte methoden moeten reeds bij het ontwerpen van de studie worden gekozen. 3. RAPPORTAGE Verslag van het onderzoek In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen : Proefdieren : - diersoort/stam; - Aantal, leeftijd en geslacht van de dieren; - herkomst, behuizing, voeding enz.; - individueel gewicht als bepaald aan het begin van de test, daarna met wekelijkse intervallen en aan het einde van de test.

Proefomstandigheden : - motivering van de keuze van het vehiculum als dit geen water was; - motivering voor de keuze van het dosisniveau; - bijzonderheden over de bereiding van het teststof/voedselpreparaat, bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat; - bijzonderheden over het toedienen van de teststof; - conversie van teststofconcentratie in voedsel/drinkwater (ppm) naar actuele dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing; - bijzonderheden over het soort voedsel en het drinkwater.

Resultaten : - lichaamsgewicht/veranderingen hierin; - voedsel- en waterconsumptie, indien van toepassing; - gegevens over de toxische respons, waaronder tekenen van toxiciteit, uitgesplitst per geslacht en dosisniveau; - aard, ernst en duur van de klinische verschijnselen (al of niet reversibel); - sensorische activiteit, grijpkracht en motorische activiteit; - hematologisch onderzoek (met relevante vergelijkingsbasis); - klinisch-biochemisch onderzoek (met relevante vergelijkingsbasis); - lichaamsgewicht bij het afmaken en gegevens over het gewicht van de organen; - resultaten van de necropsie; - een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen; - absorptiegegevens, indien beschikbaar; - statistische verwerking van de gegevens, waar relevant.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies 4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 407 van de OESO.» Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS (1) Voor een aantal bepalingen op serum en plasma, en met name voor de glucosebepaling, is een nacht vasten vóór de bloedafname wenselijk.De voornaamste reden is dat de toegenomen variabiliteit die onvermijdelijk het gevolg is van niet-vasten, subtiele effecten maskeert en de interpretatie bemoeilijkt. Daar staat tegenover dat een nacht vasten van invloed kan zijn op het algemene metabolisme van de dieren en dat dit in het bijzonder bij voedingstudies, de dagelijkse blootstelling aan de teststof verstoort. Als men de dieren een nacht laat vasten moeten de klinisch-biochemische bepalingen verricht worden na de functionele observaties in week 4 van de studie.

Bijlage II E "B.37 VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE FOSFORVERBINDINGEN NA ACUTE BLOOTSTELLING 1. METHODE 1.1. Inleiding Bij de bepaling en evaluatie van de toxische effecten van stoffen is het van belang rekening te houden met het vermogen van sommige soorten stoffen om specifieke typen neurotoxiciteit te veroorzaken die niet met andere toxiciteitstesten kunnen worden aangetoond. Bij sommige organische fosforverbindingen is waargenomen dat vertraagde neurotoxiciteit optreedt; deze stoffen moeten worden beschouwd als kandidaten voor evaluatie.

Door screening in vitro kan worden nagegaan welke stoffen vertraagde polyneuropathie kunnen veroorzaken; negatieve uitkomsten vormen echter geen bewijs dat de teststof niet neurotoxisch is.

Zie ook de algemene inleiding deel B. 1.2. Definities Organische fosforverbindingen omvatten ongeladen organische esters, thioesters of anhydriden van organische fosforzuren, organische fosforzuren of organische fosforamidezuren of van verwante fosforthiozuren, fosforthiozuren of fosforthioamidezuren, of andere stoffen die de vertraagde neurotoxiciteit kunnen veroorzaken die soms bij stoffen uit deze klasse wordt waargenomen.

Vertraagde neurotoxiciteit is een syndroom dat gepaard gaat met het langdurig vertraagde begin van ataxie, distale axonopathieën in het ruggemerg en perifere zenuwen en inhibitie en veroudering van NTE (neuropathy target esterase) in zenuwweefsel. 1.3. Referentiestoffen Een referentiestof kan worden getest met een positieve controlegroep om aan te tonen dat de respons van geteste diersoorten onder laboratoriumomstandigheden niet significant is veranderd.

Een voorbeeld van een vaak toegepaste neurotoxicum is tri-o-tolylfosfaat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS-naam : fosforzuur, tris(2,methylfenyl)ester), ook bekend als tri-o-kresylfosfaat. 1.4. Principe van de testmethode De teststof wordt oraal in één enkele dosis toegediend aan hennen die, zo nodig, beschermd zijn tegen acute cholinerge effecten. De dieren worden gedurende 21 dagen geobserveerd op abnormaal gedrag, ataxie en verlammingsverschijnselen. Bij willekeurig geselecteerde hennen uit elke groep worden, gewoonlijk 24 en 48 uur na de toediening, biochemische bepalingen verricht, met name op inhibitie van NTE. Eenentwintig dagen na de toediening worden de resterende hennen gedood en wordt histopathologisch onderzoek verricht aan geselecteerd zenuwweefsel. 1.5. Beschrijving van de testmethode 1.5.1. Voorbereidingen Gezonde jonge volwassen hennen die geen storende virusinfecties of medicatie hebben en die een normale gang vertonen worden aselect verdeeld over behandelde en controlegroepen en ten minste gedurende vijf dagen voor de aanvang van het onderzoek geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden.

De kooien of verblijven moeten zó ruim zijn, dat de hennen vrij kunnen bewegen en dat de gang van de dieren makkelijk kan worden waargenomen.

Het toedienen van de teststof gebeurt gewoonlijk langs orale weg door middel van een maagsonde, gelatinecapsules of een vergelijkbare methode.Vloeistoffen kunnen onverdund of opgelost in een geschikt vehiculum zoals maïsolie worden toegediend. Vaste stoffen moeten waar mogelijk worden opgelost omdat grote hoeveelheden vaste stof in gelatinecapsules mogelijk niet helemaal worden geresorbeerd. Van een niet-waterig vehiculum dienen de toxische eigenschappen bekend te zijn. Als dit niet zo is moeten deze voor de aanvang van de proef worden bepaald. 1.5.2. Proefomstandigheden 1.5.2.1. Proefdieren Het gebruik van jonge volwassen leghennen (Gallus gallus domesticus) van 8-12 maanden wordt aanbevolen. Er moet gebruik worden gemaakt van rassen en stammen van normale grootte en de hennen moeten zijn gefokt onder omstandigheden die vrij bewegen mogelijk maken. 1.5.2.2. Aantal en geslacht Als aanvulling op de behandelde groep moet een controlegroep (vehiculum) en een positieve controlegroep worden gebruikt. De controlegroep (vehiculum) wordt op dezelfde wijze behandeld als de behandelde groep; alleen het toedienen van de teststof wordt achterwege gelaten.

Iedere groep vogels moet uit zoveel hennen bestaan dat er ten minste zes kunnen worden gedood voor biochemische bepalingen (telkens drie op twee tijdstippen) en zes de observatieperiode van 21 dagen kunnen overleven ten behoeve van pathologisch onderzoek.

Als positieve controle kan een gelijktijdig geobserveerde groep worden gebruikt of een groep uit een recent verricht onderzoek. De groep moet uit ten minste zes hennen bestaan die worden behandeld met een stof waarvan bekend is dat deze een vertraagd neurotoxische werking heeft.

Drie hennen zijn bestemd voor biochemisch onderzoek en drie voor pathologisch onderzoek. Aangeraden wordt om gegevens uit eerdere onderzoeken periodiek aan te vullen. Als een essentieel onderdeel van de proef door het uitvoerend laboratorium wordt veranderd (bij voorbeeld stam, voedsel, behuizing), moeten nieuwe positieve controlegegevens worden ontwikkeld. 1.5.2.3. Dosisniveaus Om het dosisniveau in het hoofdonderzoek vast te stellen moet een vooronderzoek worden verricht met een voldoende aantal hennen en dosisniveaugroepen. Er dient, om een juist dosisniveau voor de hoofdstudie te kunnen vaststellen, normaal gesproken enige mortaliteit op de treden in deze voorstudie. Om echter sterfte ten gevolge van acute cholinerge effecten te voorkomen, kan atropine of een ander preventief middel, waarvan bekend is dat het niet interfereert met vertraagde neurotoxische reacties, worden toegediend. Voor het vaststellen van de maximale niet-letale dosis van teststoffen kan een aantal verschillende methoden worden gebruikt (zie methode B.1bis).

Gegevens uit eerdere onderzoeken bij de hen of andere toxicologische gegevens kunnen ook nuttig zijn bij de keuze van de dosis.

Het dosisniveau van de teststof in de hoofdstudie moet zo hoog mogelijk liggen, rekening houdend met de resultaten van de voorstudie en de bovengrens van 2 000 mg/kg lichaamsgewicht. Als er tussentijdse mortaliteit optreedt mag dit er niet toe leiden dat er te weinig proefdieren overblijven voor biochemisch (6) en pathologisch (6) onderzoek na 21 dagen. Ter voorkoming van sterfte door acute cholinerge effecten kan atropine of een ander preventief middel worden toegediend waarvan bekend is dat het niet interfereert met vertraagde neurotoxische reacties. 1.5.2.4. Limiettest Als een test op een dosisniveau van ten minste 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij gebruikmaking van de beschreven procedures voor dit onderzoek geen waarneembare toxische effecten geeft en als dit, door gegevens van proeven met structureel verwante stoffen, ook niet verwacht mag worden, kan een onderzoek waarbij van een hogere dosering gebruik wordt gemaakt achterwege blijven. De limiettest is van toepassing tenzij blootstelling bij mensen een hogere dosering noodzakelijk maakt. 1.5.2.5. Observatieperiode De observatieperiode dient 21 dagen te zijn. 1.5.3. Procedure Na toediening van een preventief middel om sterfte ten gevolge van acute cholinerge effecten te voorkomen, wordt de teststof in één enkele dosis toegediend. 1.5.3.1. Algemene observatie Het observeren moet onmiddellijk na het toedienen beginnen. Alle hennen moeten gedurende de eerste twee dagen enkele malen per dag worden geobserveerd en daarna ten minste eenmaal per dag over een periode van 21 dagen of totdat de dieren worden gedood. Alle tekenen van toxiciteit moeten worden geregistreerd, zoals tijdstip van aanvang, soort, ernst en duur van abnormaal gedrag. Ataxie moet worden gemeten op een schaalverdeling met ten minste vier niveaus en er moet worden gelet op verlammingsverschijnselen. De hennen die zijn geselecteerd voor pathologie moeten ten minste tweemaal per week uit de kooi worden genomen voor een periode van gedwongen motorische activiteit, zoals het beklimmen van een ladder, om het observeren van minimale toxische effecten te vergemakkelijken. Stervende dieren en dieren die hevige stress of pijn vertonen moeten, zodra dit wordt opgemerkt, worden verwijderd, op humane wijze worden gedood en worden geobduceerd. 1.5.3.2. Lichaamsgewicht Alle dieren worden vlak voor het toedienen van de teststof en daarna minstens éénmaal per week gewogen. 1.5.3.3. Biochemie Zes hennen die willekeurig uit iedere behandelde en vehiculumcontrolegroep worden gekozen en drie hennen uit de positieve controlegroep (als die tegelijkertijd wordt onderzocht) moeten binnen een paar dagen na toediening worden gedood. De hersenen en het lumbale ruggemerg worden geprepareerd en onderzocht op NTE-remmende effecten.

Verder kan het nuttig zijn om weefsel van de nervus ischiadicus voor hetzelfde doel te prepareren en te onderzoeken. Meestal worden van de controlegroep en alle behandelde groepen na 24 uur drie vogels gedood en na 48 uur nog eens drie, terwijl de drie hennen van de positieve controlegroep na 24 uur worden gedood. Als de waarneming van klinische verschijnselen van toxiciteit (vaak op grond van het begin van cholinerge verschijnselen) er op duidt dat de toxische stof zeer langzaam wordt uitgescheiden, kan het aan te bevelen zijn om op twee tijdstippen tussen 24 uur en maximaal 72 uur na toediening weefsel van drie vogels te verzamelen.

Bepaling van acetylcholesterinase (AChE) kan ook bij deze monsters worden uitgevoerd als dat nodig lijkt. Er kan echter spontane reactivering van AChE in vivo optreden; dit kan leiden tot onderschatting van de remmende werking van de teststof op AChE. 1.5.3.4. Macroscopische necropsie Bij macroscopische necropsie van alle (volgens plan of omdat ze stervend waren) gedode dieren moet onder meer het uiterlijk van de hersenen en het ruggemerg worden onderzocht. 1.5.3.5. Histopathologisch onderzoek Zenuwweefsel van dieren die de observatieperiode hebben overleefd en niet gebruikt zijn voor biochemisch onderzoek, moet microscopisch worden onderzocht. Het weefsel moet in situ worden gefixeerd door perfusietechnieken. Ondere andere moeten preparaten worden gemaakt van de kleine hersenen (ongeveer halverwege de lengte-as), het verlengde merg, het ruggemerg en perifere zenuwen. De preparaten van het ruggemerg moeten worden genomen uit het bovenste cervicaal segment, het midden van de thoracale regio en de lumbo-sacrale regio. Ook moeten er preparaten van het distale deel van de nervus tibialis, de vertakkingen hiervan naar de musculus gastrocnemius en van de nervus ischiadicus worden genomen. De preparaten moeten worden gekleurd met de juiste voor myeline en axonen specifieke kleurstoffen. 2. GEGEVENS Indien negatieve resultaten worden behaald met betrekking tot de parameters van deze methoden (biochemie, histopathologie en gedragsobservatie) is in het algemeen verder testen op vertraagde neurotoxiciteit niet nodig.Bij onduidelijke of dubbelzinnige resultaten voor deze parameters kan verdere evaluatie nodig zijn.

Er moeten individuele gegevens worden verstrekt. Verder moeten alle resultaten in tabelvorm worden gepresenteerd, waarbij voor iedere testgroep het aantal dieren bij aanvang moet worden vermeld, het aantal dieren dat laesies of gedrags- of biochemische effecten vertoont, het soort en de ernst van deze laesies of effecten en het percentage dieren dat een bepaalde laesie of een bepaald effect in een bepaalde mate vertoont.

De bevindingen van dit onderzoek moeten worden geëvalueerd wat betreft het voorkomen, de ernst en de correlatie van gedrags-, biochemische en histopathologische effecten en ieder ander waargenomen effect bij de behandelde en de controlegroepen.

Numerieke resultaten moeten worden geïnterpreteerd met behulp van geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methoden. De gebruikte statistische methoden moeten bij het ontwerp van het onderzoek worden gekozen. 3. RAPPORTAGE Verslag van de proefnemingen In het rapport moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen : proefdieren : - gebruikte stam; - aantal en leeftijd van de dieren; - herkomst, behuizing, enz.; - individueel gewicht van de dieren bij het begin van de proef.

Proefomstandigheden : - bijzonderheden over de bereiding van de teststof, de stabiliteit en homogeniteit, waar dat van toepassing is; - motivering van de keuze van het vehiculum; - bijzonderheden over de toediening van de teststof; - bijzonderheden over voedsel en water; - motivering van de dosiskeuze; - specificatie van de toegediende doses, met inbegrip van bijzonderheden over het vehiculum, het volume en de fysische vorm van het toegediende materiaal; - naam van het eventueel toegediende preventieve middel en gegevens over de wijze van toediening.

Resultaten : - gegevens over het lichaamsgewicht; - gegevens over de toxische respons, uitgesplitst naar groep, met inbegrip van de mortaliteit; - aard, ernst en duur van de klinische observaties (al of niet reversibel); - een gedetailleerde beschrijving van de biochemische methoden en bevindingen; - necropsieverslagen; - een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen; - statistische bewerking van de resultaten, indien van toepassing.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies. 4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 418 van de OESO. B.38 VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE FOSFORVERBINDINGEN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN) 1. METHODE 1.1. Inleiding Bij de bepaling en evaluatie van de toxische effecten van stoffen is het van belang rekening te houden met het vermogen van sommige soorten stoffen om specifieke typen neurotoxiciteit te veroorzaken die niet met andere toxiciteitstesten kunnen worden aangetoond. Bij sommige organische fosforverbindingen is waargenomen dat vertraagde neurotoxiciteit optreedt; deze stoffen moeten worden beschouwd als kandidaten voor evaluatie.

Door screening in vitro kan worden nagegaan welke stoffen vertraagde polyneuropathie kunnen veroorzaken; negatieve uitkomsten vormen echter geen bewijs dat de teststof niet neurotoxisch is.

Deze 28-daagse test op vertraagde neurotoxiciteit geeft informatie over mogelijke gevaren voor de gezondheid die zich kunnen voordoen bij herhaalde blootstelling gedurende een beperkte tijd en over de relatie tussen dosis en respons. Tevens kan op grond van de test een schatting worden gemaakt van een dosis zonder waargenomen schadelijke effecten, hetgeen van nut kan zijn bij het vaststellen van veiligheidseisen bij blootstelling.

Zie ook de algemene inleiding deel B. 1.2. Definities Organische fosforverbindingen omvatten ongeladen organische esters, thioesters of anhydriden van organische fosforzuren, organische fosforzuren of organische fosforamidezuren of van verwante fosforthiozuren, fosforthiozuren of fosforthioamidezuren, of andere stoffen die de vertraagde neurotoxiciteit kunnen veroorzaken die soms bij stoffen uit deze klasse wordt waargenomen.

Vertraagde neurotoxiciteit is een syndroom dat gepaard gaat met het langdurig vertraagde begin van ataxie, distale axonopathieën in het ruggemerg en perifere zenuwen en inhibitie en veroudering van NTE (neuropathy target esterase) in zenuwweefsel. 1.3. Principe van de testmethode Aan hennen wordt dagelijks, gedurende 28 dagen, oraal een dosis van de teststof toegediend. De dieren worden tot 14 dagen na de laatste dosis tenminste eenmaal per dag geobserveerd op abnormaal gedrag, ataxie en verlammingsverschijnselen. Bij willekeurig geselecteerde hennen uit elke groep worden, gewoonlijk 24 en 48 uur na de laatste toediening, biochemische bepalingen verricht, met name op inhibitie van NTE. Twee weken na de laatste dosis worden de resterende hennen gedood en wordt histopathologisch onderzoek verricht aan geselecteerd zenuwweefsel. 1.4. Beschrijving van de testmethode 1.4.1. Voorbereidingen Gezonde jonge volwassen hennen die geen storende virusinfecties of medicatie hebben en die een normale gang vertonen worden aselect verdeeld over behandelde en controlegroepen en ten minste gedurende vijf dagen voor de aanvang van het onderzoek geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden.

De kooien of verblijven moeten zó ruim zijn, dat de hennen vrij kunnen bewegen en dat de gang van de dieren makkelijk kan worden waargenomen.

Het toedienen van de teststof moet iedere dag plaatsvinden, zeven dagen per week, bij voorkeur door middel van een maagsonde of gelatinecapsules. Vloeistoffen kunnen onverdund of opgelost in een geschikt vehiculum zoals maïsolie worden toegediend. Vaste stoffen moeten waar mogelijk worden opgelost omdat grote hoeveelheden vaste stof in gelatinecapsules mogelijk niet helemaal worden geresorbeerd.

Van een niet-waterig vehiculum dienen de toxische eigenschappen bekend te zijn. Als dit niet zo is moeten deze voor de aanvang van de proef worden bepaald. 1.4.2. Proefomstandigheden 1.4.2.1. Proefdieren Het gebruik van jonge volwassen leghennen (Gallus gallus domesticus), 8-12 maanden oud, wordt aanbevolen. Er moet gebruik worden gemaakt van gangbare rassen en stammen van normale grootte en de hennen moeten zijn gefokt onder omstandigheden die vrij bewegen mogelijk maken. 1.4.2.2. Aantal en geslacht In het algemeen moeten ten minste drie behandelde groepen en een controlegroep (vehiculum) worden gebruikt. De controlegroep (vehiculum) wordt op dezelfde wijze behandeld als de behandelde groep; alleen het toedienen van de teststof wordt achterwege gelaten.

Iedere groep vogels moet uit zoveel hennen bestaan dat er ten minste zes kunnen worden gedood voor biochemische bepalingen (telkens drie op twee tijdstippen) en zes de observatieperiode van 14 dagen na de behandeling kunnen overleven ten behoeve van pathologisch onderzoek. 1.4.2.3. Dosisniveaus De keuze dosisniveaus moet worden gemaakt met inachtneming van de resultaten van een acute test op vertraagde neurotoxiciteit en alle andere beschikbare gegevens over toxiciteit of kinetica van de teststof. Het hoogste dosisniveau moet gekozen worden met het doel toxische effecten te veroorzaken, bij voorkeur vertraagde neurotoxiciteit, zonder dat deze leiden tot sterfte of duidelijk lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus gekozen worden om het verband tussen dosis en respons aan te tonen en bij het laagste niveau te komen tot een dosis zonder waargenomen schadelijke effecten. 1.4.2.4. Limiettest Als een test op een dosisniveau van ten minste 1000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij gebruikmaking van de beschreven procedures voor dit onderzoek geen waarneembare toxische effecten geeft en als dit, door gegevens van proeven met structureel verwante stoffen, ook niet verwacht mag worden, kan een onderzoek waarbij van een hogere dosering gebruik wordt gemaakt achterwege blijven. De limiettest is van toepassing tenzij de verwachte blootstelling bij mensen een hogere dosering noodzakelijk maakt. 1.4.2.5. Observatieperiode Alle dieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobserveerd gedurende de periode van blootstelling en 14 dagen daarna of totdat ze worden geobduceerd. 1.4.3. Procedure De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks (zeven dagen per week) aan de proefdieren toegediend. 1.4.3.1. Algemene observaties Het observeren moet onmiddellijk na de eerste toediening beginnen.

Alle hennen moeten gedurende de periode van 28 dagen waarop de stof wordt toegediend en gedurende 14 dagen daarna of totdat ze worden gedood, tenminste eenmaal per dag worden geobserveerd. Alle tekenen van toxiciteit moeten worden geregistreerd, zoals tijdstip van aanvang, soort, ernst en duur. Waarnemingen moeten onder meer, maar niet alleen, het observeren van abnormaal gedrag inhouden. Ataxie moet worden gemeten op een schaalverdeling met ten minste vier niveaus en er moet worden gelet op verlammingsverschijnselen. De hennen moeten ten minste tweemaal per week uit de kooi worden genomen voor een periode van gedwongen motorische activiteit, zoals het beklimmen van een ladder, om het observeren van minimale toxische effecten te vergemakkelijken. Stervende dieren die hevige stress of pijn vertonen moeten, zodra dit wordt opgemerkt, worden verwijderd, op humane wijze worden gedood en worden geobduceerd. 1.4.3.2. Lichaamsgewicht Alle dieren worden vlak voor het toedienen van de teststof en daarna minstens éénmaal per week gewogen. 1.4.3.3. Biochemie Zes hennen die willekeurig uit iedere behandelde en vehiculumcontrolegroep worden gekozen moeten binnen een paar dagen na toediening van de laatste dosis worden gedood. De hersenen en het lumbale ruggemerg worden geprepareerd en onderzocht op NTE-remmende effecten. Verder kan het nuttig zijn om weefsel van de nervus ischiadicus voor hetzelfde doel (NTE) te prepareren en te onderzoeken.

Meestal worden van de controlegroep en alle behandelde groepen drie vogels 24 uur en drie vogels 48 uur na de laatste dosis gedood. Als gegevens van het acute onderzoek of andere (bij voorbeeld toxicokinetische) onderzoeken er op duiden dat het doden na de laatste dosis beter op een ander tijdstip kan gebeuren, dan moet dat tijdstip aangehouden worden en de motivering worden gedocumenteerd.

Bepaling van acetylcholesterinase (AChE) kan ook bij deze monsters worden uitgevoerd als dat nodig lijkt. Er kan echter spontane reactivering van AChE in vivo optreden; dit kan leiden tot onderschatting van de remmende werking van de teststof op AChE. 1.4.3.4. Macroscopische necropsie Bij macroscopische necropsie van alle (volgens plan of omdat ze stervend waren) gedode dieren moet onder meer het uiterlijk van de hersenen en het ruggemerg worden onderzocht. 1.4.3.5. Histopathologisch onderzoek Zenuwweefsel van dieren die de observatieperiode hebben overleefd en niet gebruikt zijn voor biochemisch onderzoek, moet microscopisch worden onderzocht. Het weefsel moet in situ worden gefixeerd door perfusietechnieken. Onder andere moeten preparaten worden gemaakt van de kleine hersenen (ongeveer halverwege de lengte-as), het verlengde merg, het ruggemerg en perifere zenuwen. De preparaten van het ruggemerg moeten worden genomen uit het bovenste cervicaal segment, het midden van de thoracale regio en de lumbo-sacrale regio. Ook moeten er preparaten van het distale deel van de nervus tibialis, de vertakkingen hiervan naar de musculus gastrocnemius en van de nervus ischiadicus worden genomen. De preparaten moeten worden gekleurd met de juiste voor myeline en axonen specifieke kleurstoffen. In eerste instantie moet microscopisch onderzoek worden verricht op de geprepareerde weefsels van alle dieren uit de controlegroep en de groep met de hoogste dosis. Als er aanwijzingen zijn voor effecten in de groep met de hoogste dosering, moeten ook dieren uit de groepen met lagere doseringen worden onderzocht. 2. GEGEVENS Indien negatieve resultaten worden behaald met betrekking tot de parameters van deze methode (biochemie, histopathologie en gedragsobservatie) is in het algemeen verder testen op vertraagde neurotoxiciteit niet nodig.Bij onduidelijke of dubbelzinnige resultaten voor deze parameters kan verdere evaluatie nodig zijn.

Er moeten individuele gegevens worden verstrekt. Verder moeten alle resultaten in tabelvorm worden gepresenteerd, waarbij voor iedere testgroep moeten worden vermeld het aantal dieren bij aanvang, het aantal dieren dat laesies of gedrags- of biochemische effecten vertoont, het soort en de ernst van deze laesies of effecten en het percentage dieren dat een bepaalde laesie of een bepaald effect in een bepaalde mate vertoont.

De bevindingen van dit onderzoek moeten worden geëvalueerd wat betreft het voorkomen, de ernst en de correlatie van gedrags-, biochemische en histopathologische effecten en ieder ander waargenomen effect bij de behandelde en de controlegroepen.

Numerieke resultaten moeten worden geïnterpreteerd met behulp van geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methoden. De te gebruiken statistische methoden moeten bij het ontwerp van het onderzoek worden gekozen. 3. RAPPORTAGE Verslag van de proefnemingen In het rapport moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens worden opgenomen : Proefdieren : - gebruikte stam; - aantal en leeftijd van de dieren; - herkomst, behuizing, enz.; - individueel gewicht van de dieren bij het begin van de proef.

Proefomstandigheden : - bijzonderheden over de bereiding van de teststof, de stabiliteit en homogeniteit, waar van toepassing; - motivering van de keuze van het vehiculum; - bijzonderheden over de toediening van de teststof; - bijzonderheden over voedsel en water; - motivering van de dosiskeuze; - specificatie van de toegediende doses, met inbegrip van bijzonderheden over het vehiculum, het volume en de fysische vorm van het toegediende materiaal; - motivering van de keuze van andere tijden voor de biochemische bepaling dan 24 en 48 uur.

Resultaten : - gegevens over het lichaamsgewicht; - gegevens over de toxische respons, uitgesplitst naar dosisniveau, met inbegrip van de mortaliteit; - niveau waarop geen schadelijke effecten werden waargenomen (NOAEL); - aard, ernst en duur van de klinische observaties (al dan niet reversibel); - een gedetailleerde beschrijving van de biochemische methoden en bevindingen; - necropsieverslagen; - een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen; - statistische bewerking van de resultaten, indien dit van toepassing is.

Bespreking van de resultaten.

Conclusies. 4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 419 van de OESO.» Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS

Bijlage III A. De punten 8 en 9 van de inhoudsopgave van de bijlage worden vervangen door onderstaande punten : "8. SPECIALE GEVALLEN : stoffen 8.1. Mobiele gascilinders 8.2. Gascilinders, bedoeld voor propaan, butaan en vloeibaar petroleumgas (LPG) 8.3. Metalen in massieve vorm 8.4. Stoffen die zijn ingedeeld met waarschuwingszin R65 9. SPECIALE GEVALLEN : preparaten 9.1. Gasvormige preparaten (gasmengsels) 9.2. Gascilinders, bedoeld voor preparaten die propaan, butaan en vloeibaar petroleumgas (LPG) bevatten, waaraan een stinkende stof is toegevoegd 9.3. Legeringen, preparaten die polymeren bevatten, preparaten die elastomeren bevatten 9.4. Preparaten die zijn ingedeeld met waarschuwingszin R65 9.5. Organische peroxiden" B. De volgende tekst wordt ingevoegd onder punt 3.2.3, na de criteria in verband met R20 "Schadelijk bij inademing" : "R65 Schadelijk : kan longschade veroorzaken na verslikken Vloeibare stoffen en preparaten die een inademingsgevaar opleveren voor de mens vanwege hun lage viscositeit : a) Stoffen en preparaten die alifatische (al dan niet cyclisch) en aromatische koolwaterstoffen in een totale concentratie van ten minste 10 % bevatten, en welke - hetzij een doorstroomtijd van minder dan 30 sec.in een 3 mm ISO-beker overeenkomstig EN 535, - hetzij een kinematische viscositeit, gemeten met een gekalibreerde glazen capillaire viscosimeter volgens ISO-norm 3104/3105, van minder dan 7 x 10-6 m2/sec. bij 40 °C, - hetzij een kinematische viscositeit, gemeten met een rotatieviscosimeter volgens ISO-norm 3219, van minder dan 7 x 10-6 m2/sec. bij 40 °C hebben.

Merk op dat stoffen en preparaten die aan bovengenoemde criteria voldoen niet als schadelijk behoeven te worden ingedeeld als hun gemiddelde oppervlaktespanning groter is dan 25 mN/m bij 40 °C. b) Andere stoffen en preparaten, die niet voldoen aan bovengenoemde criteria, op basis van praktische ervaring bij de mens.» C. De tekst van punt 3.2.6.3 wordt vervangen door de volgende tekst : "3.2.6.3. Irriterend voor de ademhalingswegen De volgende waarschuwingszin wordt toegekend overeenkomstig de gegeven criteria : R37 Irriterend voor de ademhalingswegen Stoffen en preparaten die ernstige irritatie voor de ademhalingswegen veroorzaken, op grond van : - waarnemingen bij de mens; - positieve resultaten van geschikte dierproeven.

Opmerking in verband met het gebruik van waarschuwingszin R37 Bij de interpretatie van de waarnemingen bij de mens moet zorgvuldig een onderscheid worden gemaakt tussen effecten die leiden tot een indeling met waarschuwingszin R48 (zie punt 3.2.4) en effecten die leiden tot indeling met zin R37. Effecten die tot indeling met zin R37 leiden, zijn omkeerbaar en zijn doorgaans beperkt tot de bovenste luchtwegen.

Positieve resultaten van geschikte dierproeven kunnen gegevens omvatten die verkregen zijn met behulp van een algemene toxiciteitstest, met inbegrip van histopathologische gegevens met betrekking tot het ademhalingsstelsel. Om de irritatie van luchtwegen te evalueren mogen ook gegevens uit de meting van experimentele bradypnee worden gebruikt. » D. De tekst van punt 3.2.7 Sensibiliserend wordt vervangen door de volgende tekst : "3.2.7. Sensibiliserend 3.2.7.1. Overgevoeligheid bij inademing Stoffen en preparaten worden ingedeeld als sensibiliserend en gekenmerkt met het symbool Xn, de aanduiding "schadelijk" en de waarschuwingszin R42 overeenkomstig de onderstaande criteria : R42 Kan overgevoeligheid veroorzaken bij inademing - indien er gegevens zijn dat de stoffen of preparaten door inademing specifieke overgevoeligheidsreacties kunnen veroorzaken; - indien er positieve resultaten zijn van geschikte dierproeven; - indien de stof een isocyanaat is, tenzij bewezen is dat de stof bij inademing geen overgevoeligheid veroorzaakt.

Opmerkingen m.b.t. het gebruik van R42 Gegevens bij de mens Gegevens dat een stof door inademing specifieke overgevoeligheidsreacties kan veroorzaken, zullen normaal gebaseerd zijn op waarnemingen bij de mens. In die context wordt bij overgevoeligheid doorgaans aan astma gedacht, maar ook andere overgevoeligheidsreacties, zoals rhinitis en alveolitis, moeten worden beschouwd. De conditie moet het klinisch karakter van een allergische reactie hebben. Immunologische mechanismen behoeven echter niet te worden aangetoond.

Bij de evaluatie van de gegevens met betrekking tot de blootstelling bij de mens moet, alvorens een beslissing wordt genomen inzake de indeling van de stof, ook rekening worden gehouden met : - de omvang van de blootgestelde populatie; - de mate van blootstelling.

Met bovengenoemde gegevens wordt bedoeld : - klinische voorgeschiedenis en resultaten van geschikte longfunctieproeven m.b.t. de blootstelling aan de stof, bevestigd door aanvullende bewijzen zoals : - een chemische structuur die verwant is aan de structuur van stoffen waarvan bekend is dat zij bij inademing overgevoeligheidsreacties veroorzaken; - in vivo immunologische proeven (b.v. huidprikken); - in vitro immunologische proeven (b.v. serologische analyse); - studies die kunnen wijzen op andere specifieke, maar niet-immunologische werkingsmechanismen, b.v. herhaaldelijke beperkte irritatie, effecten van geneesmiddelen. - resultaten van positieve bronchiale provocatieproeven met de stof, verricht overeenkomstig algemeen aanvaarde richtsnoeren voor de bepaling van specifieke overgevoeligheidsreacties.

De klinische voorgeschiedenis moet zowel het medische als het beroepsverleden omvatten, zodat het verband kan worden vastgesteld tussen de blootstelling aan een specifieke stof en het ontstaan van overgevoeligheid bij inademing. Tot de relevante informatie behoren eveneens verergerende factoren thuis en op het werk, het begin en het verloop van de ziekte, familiale voorgeschiedenis en medische voorgeschiedenis van de patient. In de medische voorgeschiedenis moet ook worden vermeld of er andere allergische reacties of aandoeningen van de luchtwegen in de kinderjaren zijn voorgekomen en of men roker is (geweest).

De resultaten van positieve bronchiale provocatieproeven worden op zich als voldoende bewijs voor de indeling beschouwd. In de praktijk zullen echter reeds een groot aantal van bovengenoemde onderzoeken zijn verricht.

Aan stoffen die slechts bij mensen met een bronchiale hyperreactiviteit door middel van irritatie symptomen van astma oproepen, behoeft geen R42 zin te worden toegekend.

Dierproeven Tot de gegevens van testen die indicatief zijn voor mogelijke overgevoeligheidsreacties via inademing bij de mens behoren de resultaten van : - IgE-metingen (b.v. bij muizen); - specifieke pulmonaire reacties bij cavia's. 3.2.7.2. Overgevoeligheid bij contact met de huid Stoffen en preparaten worden ingedeeld als sensibiliserend en gekenmerkt met het symbool Xi, de gevaarsaanduiding "irriterend" en de waarschuwingszin R43 overeenkomstig de onderstaande criteria : R43 Kan overgevoeligheid veroorzaken bij contact met de huid - indien uit de praktijk blijkt dat de stoffen en preparaten bij een aanzienlijk aantal mensen via huidcontact een overgevoeligheidsreactie teweeg kunnen brengen; - op grond van positieve reacties bij proefdieren.

Opmerkingen m.b.t. het gebruik van R43 Gegevens bij de mens De volgende gegevens (ervaring uit de praktijk) volstaan om een stof in te delen met zin R43 : - positieve resultaten van geschikte patch-tests, normaliter in meer dan één dermatologische kliniek, of - epidemiologische studies waaruit blijkt dat de stof allergische contactdermatitis veroorzaakt. Situaties waarbij een groot deel van de blootgestelden karakteristieke symptomen vertoont moeten met bijzondere aandacht worden bekeken, zelfs wanneer het aantal gevallen klein is, of - positieve resultaten van experimentele studies bij de mens (zie ook 3.1.1).

De volgende aanwijzingen volstaan om aan een stof zin R43 toe te kennen wanneer er ondersteunende gegevens zijn : - afzonderlijke episodes van allergische contactdermatitis, of - epidemiologische studies waarbij toeval, vooroordeel of verstoringen niet volledig met redelijke zekerheid kunnen worden uitgesloten.

Als ondersteunende gegevens kunnen gelden : - resultaten van overeenkomstig de bestaande richtlijnen uitgevoerde dierproeven, die niet geheel voldoen aan de in het hoofdstuk over dierproeven gegeven criteria, maar die de limiet voldoende benaderen om als betekenisvol te kunnen worden beschouwd, of - niet met standaardmethoden verkregen gegevens, of - geschikte structuuractiviteitsrelaties.

Dierproeven Positieve resultaten van geschikte dierproeven zijn : bij toepassing van de in bijlage V opgenomen adjuvans-testmethode voor overgevoeligheid van de huid of van andere typen testmethoden die gebruik maken van een adjuvans, wordt een respons van ten minste 30 % van de dieren als positief beschouwd. Voor elke andere testmethode wordt een respons van ten minste 15 % van de dieren als positief beschouwd. 3.2.7.3. Immunologische contacturticaria Sommige stoffen die voldoen aan de criteria voor R42 kunnen daarenboven immunologische contacturticaria veroorzaken. In dat geval moet informatie betreffende contacturticaria worden aangegeven door gebruik van de passende S-zinnen, doorgaans S24 en S36/37, alsmede door opname van die informatie in het inlichtingenblad aangaande de veiligheid.

Met betrekking tot stoffen waarvoor aanwijzingen bestaan dat ze immunologische contacturticaria veroorzaken, en welke niet voldoen aan de criteria voor toekenning van zin R42, moet toekenning van zin R43 worden overwogen.

Er is geen erkend diermodel beschikbaar ter identificatie van stoffen die immunologische contacturticaria veroorzaken. Een desbetreffende indeling zal doorgaans gebeuren op basis van gegevens bij de mens, en wel op soortgelijke wijze als in verband met overgevoeligheid bij contact met de huid (R43). 3.2.7.4. Opgemerkt wordt dat indien het symbool Xn en de gevaarsaanduiding "schadelijk" zijn toegekend, het symbool Xi en de gevaarsaanduiding "irriterend" facultatief zijn. » E. De tekst van de criteria voor toekenning van veiligheidsaanbeveling S62 onder punt 6 wordt vervangen door de volgende tekst : "S62 Bij inslikken niet het braken opwekken; direct een arts raadplegen en de verpakking of het etiket tonen - Toepassing : - stoffen en preparaten die als schadelijk zijn ingedeeld en waaraan R65 is toegekend overeenkomstig de in punt 3.2.3 gegeven criteria; - niet van toepassing op stoffen en preparaten die in spuitbussen (of in houders die zijn voorzien van een vaste verstuiver) op de markt worden gebracht; zie onder de punten 8 en 9. - Gebruikscriteria : - verplicht voor de bovengenoemde stoffen en preparaten indien ze aan het grote publiek worden verkocht of waarschijnlijk door het grote publiek worden gebruikt; - aanbevolen voor de bovengenoemde stoffen en preparaten wanneer die in de industrie worden gebruikt. » F. Het volgende punt wordt toegevoegd onder punt 8 : "8.2. Gascilinders, bedoeld voor propaan, butaan of vloeibaar petroleumgas (LPG) Deze stoffen zijn ingedeeld in bijlage I. Hoewel zij zijn ingedeeld overeenkomstig artikel 1, § 4, vormen zij geen gevaar voor de volksgezondheid wanneer zij op de markt worden gebracht in afgesloten navulbare cilinders of in niet-navulbare gashouders in de zin van EN 417 als brandstof, waarbij zij alleen vrijkomen voor verbranding.

Bedoelde cilinders of patronen moeten worden gekenmerkt met het passende symbool en de R- en S-zinnen betreffende hun ontvlambaarheid.

Op het etiket behoeft geen informatie over de effecten op de volksgezondheid worden vermeld. De normaliter op het etiket te vermelden informatie betreffende de effecten op de volksgezondheid dient evenwel door de persoon die verantwoordelijk is voor het in de handel brengen van de stof in de in artikel 9, § 2, van dit besluit omschreven vorm aan de professionele gebruiker te worden verstrekt.

Aan de consument moet voldoende informatie worden verstrekt om hem in staat te stellen alle in artikel 12, § 3, van het Koninklijk Besluit van 11 januari 1993, omschreven maatregelen op het gebied van bescherming van de veiligheid en gezondheid te nemen. » G. Het hoofdje van punt "8.2 Metalen in massieve vorm" wordt vervangen door : "8.3. Metalen in massieve vorm" H. Het volgende punt wordt toegevoegd onder punt 8 : "8.4. Stoffen waaraan zin R65 is toegekend Stoffen die als schadelijk zijn ingedeeld op basis van gevaren bij inademing moeten niet als schadelijk met toekenning van R65 worden ingedeeld wanneer zij op de markt worden gebracht in spuitbussen of houders voorzien van een vaste verstuiver. » I. De tekst van punt 9.1.3 wordt vervangen door onderstaande tekst : "9.1.3. Etikettering Voor mobiele gascilinders geldt dat aan de etiketteringseisen geacht wordt te zijn voldaan wanneer die in overeenstemming zijn met artikel 10, § 5, van het Koninklijk Besluit van 11 januari 1993.

In afwijking van artikel 10, § 1 en 2, kunnen bij gascilinders met een watercapaciteit van ten hoogste 150 liter voor de opmaak en de afmetingen van het etiket evenwel de bepalingen van ISO-norm ISO/DP 7225 worden gevolgd. In dat geval mag het etiket de gangbare benaming of industriële/handelsbenaming van het preparaat dragen, vooropgesteld dat de namen van de gevaarlijke stoffen in het preparaat duidelijk en onuitwisbaar op de buitenkant van de gascilinder worden vermeld.

De in artikel 9 bedoelde informatie mag worden verstrekt op een duurzaam informatieplaatje of -schijfje dat in de houder is geïntegreerd. » J. Het volgende punt wordt toegevoegd onder punt 9 : "9.2. Gascilinders, bedoeld voor propaan, butaan of vloeibaar petroleumgas (LPG) waaraan een stinkende stof is toegevoegd Propaan, butaan en vloeibaar petroleumgas (LPG) zijn ingedeeld in bijlage I. Hoewel de preparaten die deze stoffen bevatten zijn ingedeeld overeenkomstig artikel 5 van het KB van 11 januari 1993, vormen zij geen gevaar voor de volksgezondheid wanneer zij op de markt worden gebracht in afgesloten navulbare cilinders of in niet-navulbare gashouders in de zin van EN 417 als brandstof, waarbij zij alleen vrijkomen voor verbranding.

Bedoelde cilinders en patronen moeten worden gekenmerkt met het passende symbool en de R- en S-zinnen betreffende hun ontvlambaarheid.

Op het etiket behoeft geen informatie over de effecten op de gezondheid van de mens te worden vermeld. De normaliter op het etiket te vermelden informatie betreffende de effecten op de gezondheid van de mens dient evenwel door de persoon die verantwoordelijk is voor het in de handel brengen van het preparaat in de in artikel 12 van het KB van 11 januari 1993 omschreven vorm aan de professionele gebruiker te worden verstrekt. Aan de consument moet voldoende informatie worden verstrekt om hem in staat te stellen alle in artikel 12, § 3, van het KB van 11 januari 1993 omschreven maatregelen op het gebied van bescherming van de veiligheid en gezondheid te nemen. » K. Het hoofdje van punt "9.2 Legeringen, preparaten die polymeren bevatten, preparaten die elastomeren bevatten" wordt vervangen door : "9.3. Legeringen, preparaten die polymeren bevatten, preparaten die elastomeren bevatten" L. Het volgende punt wordt toegevoegd onder punt 9 : "9.4. Preparaten waaraan zin R65 is toegekend Preparaten die als schadelijk zijn ingedeeld op basis van gevaren bij inademing behoeven niet als schadelijk met toekenning van R65 worden ingedeeld wanneer zij op de markt worden gebracht in spuitbussen of houders voorzien van een vaste verstuiver. » M. Het hoofdje van punt "9.4 Organische peroxiden" wordt vervangen door : "9.5. Organische peroxiden" Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS