publié le 16 janvier 1999
Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement
- source
- ministere des affaires sociales, de la sante publique et de l'environnement
- numac
- 1998022834
- pub.
- 16/01/1999
- prom.
- 14/12/1998
- ELI
- eli/arrete/1998/12/14/1998022834/moniteur
- moniteur
- https://www.ejustice.just.fgov.be/cgi/article_body(...)
- liens
- Conseil d'État (chrono)
14 DECEMBRE 1998. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement
ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et à venir, Salut.
Vu la loi du 24 février 1921Documents pertinents retrouvés type loi prom. 24/02/1921 pub. 17/12/2004 numac 2004000617 source service public federal interieur Loi concernant le trafic des substances vénéneuses, soporifiques, stupéfiantes, désinfectantes ou antiseptiques. - Traduction allemande fermer concernant le trafic des substances vénéneuses, soporifiques, stupéfiantes, désinfectantes et antiseptiques, notamment l'article 1er, modifié par les lois des 11 mars 1958, 1er juillet 1976 et 14 juillet 1994;
Vu la loi du 4 août 1996Documents pertinents retrouvés type loi prom. 04/08/1996 pub. 24/07/1997 numac 1996015142 source ministere des affaires etrangeres, du commerce exterieur et de la cooperation au developpement Loi portant approbation de la Convention entre le Royaume de Belgique et la République Arabe d'Egypte tendant à éviter les doubles impositions et à prévenir l'évasion fiscale en matière d'impôts sur le revenu, signée au Caire le 3 janvier 1991 type loi prom. 04/08/1996 pub. 08/06/2005 numac 2005015073 source service public federal affaires etrangeres, commerce exterieur et cooperation au developpement Loi portant assentiment à la Convention entre le Royaume de Belgique et la République gabonaise tendant à éviter la double imposition et à prévenir l'évasion fiscale en matière d'impôts sur le revenu et sur la fortune, signée à Bruxelles le 14 janvier 1993 type loi prom. 04/08/1996 pub. 21/10/1999 numac 1999015088 source ministere des affaires etrangeres, du commerce exterieur et de la cooperation internationale Loi portant assentiment au Protocole entre le gouvernement du Royaume de Belgique et le gouvernement de la République française relatif aux allocations de naissance, signé à Bruxelles, le 26 avril 1993 fermer relative au bien-être des travailleurs lors de l'exécution de leur travail;
Vu la loi du 28 mai 1956 relative aux substances et mélanges explosibles ou susceptibles de déflagrer et aux engins qui en sont chargés;
Vu la loi du 11 juillet 1969 relative aux pesticides et aux matières premières pour l'agriculture, l'horticulture, la sylviculture et l'élevage;
Vu la loi du 24 janvier 1977 relative à la protection de la santé des consommateurs en ce qui concerne les denrées alimentaires et les autres produits, modifiée par la loi du 22 mars 1989;
Vu la loi du 14 juillet 1991Documents pertinents retrouvés type loi prom. 14/07/1991 pub. 28/11/2007 numac 2007000956 source service public federal interieur Loi sur les pratiques du commerce et sur l'information et la protection du consommateur. - Traduction allemande de dispositions modificatives type loi prom. 14/07/1991 pub. 14/01/2008 numac 2007001065 source service public federal interieur Loi sur les pratiques du commerce et sur l'information et la protection du consommateur. - Traduction allemande de dispositions modificatives fermer sur les pratiques du commerce, et sur l'information et la protection du consommateur, modifiée par la loi du 5 novembre 1993;
Vu la directive 67/548/CEE du Conseil des Communautés européennes du 27 juin 1967 concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses, modifiée en dernier lieu par la directive 96 /56/CE du Parlement européen et du Conseil du 3 septembre 1996;
Vu la directive 94/69/CE de la Commission du 19 décembre 1994 portant vingt et unième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses;
Vu la directive 96/54/CE de la Commission du 30 juillet 1996 portant vingt-deuxième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses;
Vu l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement, modifié par les arrêtés royaux des 14 février 1985, 14 septembre 1989, du 19 juillet 1994 et du 13 novembre 1997, ainsi que l'arrêté royal du 14 septembre 1993 portant désignation des services et fonctionnaires chargés de rechercher et de constater les infractions aux dispositions de l'arrêté royal du 24 mai 1982 précité;
Vu l'arrêté royal du 27 octobre 1988 relatif à l'application des principes de bonnes pratiques de laboratoire et au contrôle de leur application pour les essais sur les substances chimiques ainsi que l'arrêté royal du 14 novembre 1993 relatif à la protection des animaux d'expérience;
Vu l'arrêté royal du 11 janvier 1993 réglementant la classification, l'emballage et l'étiquetage des préparations dangereuses en vue de leur mise sur le marché ou de leur emploi modifié par l'arrêté royal du 23 juin 1995, et l'arrêté royal du 14 juillet 1998;
Vu l'avis du Conseil supérieur pour la Prévention et la Protection au Travail du 16 octobre 1998;
Vu les lois sur le Conseil d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973, notamment l'article 3, § 1er, modifié par les lois des 9 août 1980, 16 juin 1989 et 4 juillet 1989;
Vu l'urgence;
Considérant qu'il convient de transposer, sans retard, la directive 94/69/CE du 19 décembre 1994 dont le délai de transposition est dépassé depuis le 1er septembre 1996 et la directive 96/54/CE du 30 juillet 1996 dont le délai de transposition est dépassé en partie depuis le 31 octobre 1997 et pour le reste depuis le 31 mai 1998.
Considérant que la Cour de Justice des Communautés européennes a condamné la Belgique, le 6 octobre 1998, en raison de non transposition de la directive 94/69/CE du 19 décembre 1994 dans l'Affaire C-79/98;
Sur la proposition de Notre Ministre de la Santé publique, de Notre Ministre de l'Emploi et du Travail et de Notre Secrétaire d'Etat à l'Environnement, Nous avons arrêté et arrêtons :
Article 1er.Les annexes de l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement, modifié par les arrêtés royaux des 14 février 1985, 14 septembre 1989, 19 juillet 1994 et 13 novembre 1997 sont modifiées comme suit : - L'annexe I est remplacée par l'annexe I du présent arrêté; - L'annexe V, point B, est modifiée comme suit : a) Le texte de l'annexe II, point A, du présent arrêté remplace le titre et l'introduction générale de la partie B : "Méthodes pour la détermination de la toxicité". b) Le texte de l'annexe II, point B, du présent arrêté est inséré après le point B.1bis. c) Le texte de l'annexe II, point C, du présent arrêté remplace le point B.6. d) Le texte de l'annexe II, point D, du présent arrêté remplace le point B.7. e) Le texte de l'annexe II, point E, du présent arrêté est ajouté à la fin. - Le texte de l'annexe III du présent arrêté remplace le texte indiqué à l'annexe VI.
Art. 2.Notre Ministre de la Santé publique, Notre Ministre de l'Emploi et du Travail et Notre Secrétaire d'Etat à l'Environnement sont chargés, chacun en ce qui le concerne, de l'exécution du présent arrêté.
Donné à Bruxelles, le 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe I Liste des substances dangereuses La liste des substances dangereuses, mentionnée à cette annexe, est identique à celle qui figure à l'annexe III, partie I de l'arrêté royal du 11 janvier 1993 réglementant la classification, l'emballage et l'étiquetage des préparations dangereuses en vue de leur mise sur le marché ou de leur emploi modifié par l'arrêté royal du 23 juin 1995, et l'arrêté royal du 14 juillet 1998.
Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe II A « PARTIE B: METHODES DE DETERMINATION DE LA TOXICITE ET DES AUTRES EFFETS SUR LA SANTE INTRODUCTION GENERALE: PARTIE B A. NOTE EXPLICATIVE Pour la présente introduction, la numérotation est la suivante: B.15 Mutation génique, Saccharomyces cerevisiae B.16 Recombinaison mitotique, Saccharomyces cerevisiae B.17 Cellules de mammifère in vitro, essai de mutation génique B.18 Lésion et réparation de l'ADN - synthèse non programmée de l'ADN (UDS) cellules de mammifère in vitro B.19 Essai in vitro d'échange de chromatides soeurs B.20 Test de létalité récessive liée au sexe chez Drosophila melanogaster B.21 Tests de transformation sur cellules de mammifère in vitro B.22 Tests de létalité dominante chez le rongeur B.23 Test cytogénétique sur cellules germinales de mammifère in vivo B.24 Spot test chez la souris B.25 Translocation héréditaire chez la souris B.26 Toxicité orale subchronique: étude de 90 jours sur des rongeurs B.27 Toxicité orale subchronique: étude de 90 jours sur des espèces n'appartenant pas à l'ordre des rongeurs B.28 Toxicité dermique subchronique: étude de 90 jours sur des rongeurs B.29 Toxicité subchronique par inhalation: étude de 90 jours sur des rongeurs B.30 Etude de la toxicité chronique B.31 Etude de tératogénicité B.32 Etude de cancérogénèse B.33 Etude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité B.34 Test de reproduction sur une génération B.35 Test de reproduction sur deux générations B.36 Toxicocinétique B. DEFINITIONS GENERALES DES TERMES EMPLOYES DANS LES METHODES D'ESSAI FIGURANT DANS LA PRESENTE ANNEXE i) La toxicité aiguë correspond aux effets indésirables qui se manifestent dans un intervalle de temps donné (généralement 14 jours) après administration d'une dose unique d'une substance. ii) La toxicité évidente est un terme général qui décrit les signes manifestes de toxicité résultant de l'administration d'une substance d'essai. Ces signes doivent être suffisamment marqués pour permettre une évaluation des dangers et sont tels qu'une augmentation de la dose administrée est susceptible d'entraîner des effets toxiques graves et éventuellement la mort. iii) La dose est la quantité de substance administrée. Elle est exprimée en poids (gramme et milligramme) ou en poids de substance d'essai par unité de poids corporel de l'animal d'expérience (par exemple, milligrammes par kilogramme de poids corporel), ou encore en concentration alimentaire constante (parties par million ou milligrammes par kilogramme d'aliment). iv) La dose discriminante est la plus forte des quatre doses fixées pouvant être administrée sans entraîner une mortalité liée à la substance (y compris animaux sacrifiés pour raisons humanitaires). v) Le dosage est un terme général qui comprend la dose administrée, ainsi que la fréquence et la durée d'administration. vi)
B.I Toxicité aiguë - toxicité par administration répétée/toxicité subchronique et chronique Divers essais (méthodes B.1 - B.5) permettent d'évaluer les effets toxiques et la toxicité aiguë d'une substance pour l'ensemble de l'organisme ou pour certains organes; suite à l'administration d'une dose unique, ces essais fournissent une première indication de la toxicité de la substance.
En fonction de la toxicité de la substance, on peut envisager un essai limite jusqu'à une étude complète menant à l'établissement d'une DL50, bien qu'aucun essai limite ne soit prescrit pour les études par inhalation puisqu'il n'a pas été possible de définir une valeur limite unique pour l'exposition par inhalation.
La préférence doit être accordée aux méthodes qui utilisent le moins d'animaux possible et qui minimisent les souffrances de ces derniers, par exemple, la « méthode des doses fixes » : (méthode B.1 bis) et la « méthode de toxicité aiguë » : (méthode B.1 ter). Pour les essais de niveau 1, une étude sur une seconde espèce peut compléter les conclusions de la première étude. Dans ce cas, on utilisera une méthode d'essai standard ou on adaptera la méthode pour un plus petit nombre d'animaux.
L'essai de toxicité par administration répétée (méthodes B.7, B.8 et B.9) comporte une évaluation des effets toxiques résultant d'une exposition répétée. L'observation clinique des animaux doit être minutieuse, afin de recueillir le maximum d'informations possible. Ces essais doivent permettre de déterminer la toxicité sur les organes cibles, ainsi que les doses non toxiques. Ces aspects pourront nécessiter une analyse plus approfondie dans les études à long terme (méthodes B.26 - B.30 et B.33).
B.II Mutagénicité - Génotoxicité La mutagénicité concerne l'induction de modifications permanentes et transmissibles, la quantité ou la structure du matériel génétique des cellules ou des organismes. Ces modifications ou « mutations » : peuvent concerner un gène unique ou des segments d'un gène, un bloc de gènes ou des chromosomes entiers. Les effets sur les chromosomes (entiers) peuvent être structurels et/ou numériques.
L'activité mutagène d'une substance est évaluée à l'aide d'essais in vitro, sur des bactéries (méthode B.13/14) pour les mutations géniques (ponctuelles), et/ou sur des cellules de mammifères pour les aberrations chromosomiques structurelles (méthode B.10).
Les méthodes in vivo sont également acceptables, par exemple l'essai du micronoyau (méthode B.12) ou l'analyse de métaphase de cellules de moelle osseuse (méthode B.11). Néanmoins, et en l'absence de contre-indication, les méthodes in vitro sont nettement préférables.
Les gros volumes de production peuvent nécessiter des études complémentaires pour préciser le potentiel mutagène d'une substance ou effectuer des essais préliminaires de dépistage d'un éventuel effet cancérogène, et/ou réaliser ou assurer le suivi de l'évaluation des risques et ces études peuvent avoir plusieurs utilités : confirmer les résultats des essais de base, analyser des critères non étudiés (end-points) dans les essais de base, servir de point de départ ou de complément à des études in vivo.
A cet effet, les méthodes B.15 à B.25 utilisent des systèmes eucaryotes in vivo et in vitro et portent sur une plus large série de systèmes biologiques. Ces essais fournissent des informations sur les mutations ponctuelles et sur d'autres critères chez des organismes plus complexes que les bactéries utilisées dans les essais de base.
En règle générale, lorsqu'un programme complémentaire d'études de mutagénicité est envisagé, celui-ci doit être conçu pour permettre l'obtention d'informations complémentaires pertinentes sur le potentiel mutagène ou cancérogène de la substance en question.
Les études qui s'avèrent nécessaires dans un cas précis dépendent de nombreux facteurs, notamment des caractéristiques physiques et chimiques de la substance, des résultats des premiers essais bactériens et cytogénétiques, du profil métabolique de la substance, des résultats d'autres études de toxicité et des utilisations connues de la substance. Etant donné la diversité des facteurs à prendre en considération, un schéma rigide de sélection des essais ne semble pas opportun.
L'A.R. du 13 novembre 1997 définit certains principes généraux en matière de stratégie, mais un document, le guide technique pour l'Evaluation des Risques présente des stratégies précises qui sont néanmoins souples et peuvent être adaptées en fonction des circonstances.
Les méthodes d'études complémentaires ont néanmoins été regroupées ci-après, en fonction du principal paramètre (end-point) génétique analysé.
Etudes portant sur les mutations géniques (ponctuelles) a) Etudes des mutations directes ou inverses sur micro-organismes eucaryotes (Saccharomyces cerevisiae) (méthode B.15) b) Etudes in vitro des mutations directes sur cellules de mammifère (méthode B.17) c) Test de létalité récessive liée au sexe sur Drosophila melanogaster (méthode B.20) d) Test de mutation génétique sur cellules somatique in vivo, test des taches chez la souris (spot test - méthode B.24) Etudes portant sur les aberrations chromosomiques a) Etudes cytogénétiques in vivo chez les mammifères;une analyse en métaphase des cellules de moelle osseuse in vivo doit être envisagée lorsqu'elle n'a pas été réalisée lors de l'évaluation initiale (méthode B.11). Il est en outre possible d'étudier la cytogénétique des cellules germinales in vivo (méthode B.23) b) Etudes cytogénétiques in vitro sur cellules de mammifère, lorsqu'elles n'ont pas été réalisées lors de l'évaluation initiale (méthode B.10) c) Etudes de létalité dominante chez les rongeurs (méthode B.22) d) Test de translocation héréditaire chez la souris (méthode B.25) Effets génotoxiques - effets sur l'ADN La génotoxicité, caractérisée par des altérations potentielles du matériel génétique non nécessairement liées à la mutagénicité, peut se manifester par des lésions de l'ADN sans preuve directe de mutation.
Les méthodes ci-après qui utilisent des micro-organismes eucaryotes ou des cellules de mammifère peuvent s'avérer utiles pour étudier ces phénomènes : a) Recombinaison mitotique sur Saccharomyces cerevisiae (méthode B.16) b) Lésion et réparation de l'ADN - synthèse non programmée de l'ADN sur cellules de mammifère - in vitro (méthode B.18) c) Echange de chromatides soeurs sur cellules de mammifère - in vitro (méthode B.19) Méthodes alternatives pour la recherche du potentiel cancérogène Des tests de transformation sur cellules de mammifère permettent de mesurer la capacité d'une substance à induire, dans une culture cellulaire, des modifications morphologiques et comportementales qui sont supposées être associées à une transformation maligne in vivo (méthode B.21). Un certain nombre de types cellulaires et de critères de transformation différents peuvent être utilisés.
Evaluation du risque d'effets héréditaires chez les mammifères Il existe plusieurs méthodes qui permettent de mesurer, chez les mammifères, les effets héréditaires induits par des mutations géniques (ponctuelles), par exemple, le test du locus spécifique chez la souris qui permet de mesurer les mutations intervenues sur les cellules germinales dans la première génération (non décrit dans la présente annexe), ou par des aberrations chromosomiques, par exemple, le test de translocation héréditaire chez la souris (méthode B.25). Ces méthodes peuvent être utilisées pour apprécier le risque génétique que peut présenter une substance pour l'homme. Toutefois, étant donné la complexité de ces essais et le nombre élevé d'animaux requis, en particulier pour le test du locus spécifique, ces études ne doivent être entreprises que lorsqu'elles sont pleinement justifiées.
B.III Cancérogénicité Les substances chimiques peuvent être considérées comme des agents cancérogènes génotoxiques ou non génotoxiques, selon le mécanisme d'action présumé.
Les études de mutagénicité/génotoxicité peuvent fournir des informations préalables permettant de dépister le potentiel cancérogène génotoxique d'une substance. Des informations complémentaires seront fournies par les essais de toxicité par administration répétée, de toxicité subchronique ou de toxicité chronique. L'essai de toxicité par administration répétée, méthode B.7 et les études de toxicité à plus long terme comprennent une évaluation des modifications histopathologiques observées, par exemple de l'hyperplasie de certains tissus, qui peuvent être inquiétantes. Ces études ainsi que les informations toxicocinétiques peuvent aider à mettre en évidence les substances chimiques ayant un potentiel cancérogène qui pourrait alors être approfondi dans le cadre d'un essai de cancérogénicité (méthode B.32) ou souvent d'une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité (méthode B.33).
B.IV Toxicité pour la reproduction La toxicité pour la reproduction peut se manifester de différentes façons, notamment par des troubles de la fonction ou de la capacité reproductrice mâle ou femelle, qualifiés d'« effet sur la fertilité » :, ou par l'apparition d'effets néfastes non transmissibles chez les descendants, qualifiés de -*toxicité pour le développement »- : qui englobe également la tératogénicité et les effets durant l'allaitement.
Pour les études de tératogénicité qui font partie de l'étude de la toxicité pour le développement, la méthode d'essai (méthode B.31) porte principalement sur l'administration par voie orale. D'autres voies d'administration sont également possibles en fonction des propriétés physiques de la substance d'essai ou de la voie probable d'exposition humaine. Dans de tels cas, la méthode d'essai doit être convenablement adaptée en tenant compte des éléments pertinents des méthodes d'essai sur 28 jours.
Lorsqu'une étude de la reproduction sur trois générations (fertilité) s'avère nécessaire, il est possible d'utiliser la méthode décrite pour le test de reproduction sur deux générations (méthode B.35) en l'appliquant à une troisième génération.
B.V Neurotoxicité La neurotoxicité peut se manifester de différentes façons, à savoir par des modifications fonctionnelles et/ou structurelles et par des modifications biochimiques au niveau du système nerveux central ou périphérique. Les essais de toxicité aiguë peuvent donner une première indication de la neurotoxicité. L'essai de toxicité par administration répétée, méthode B.7, comporte une évaluation des effets neurotoxiques; l'observation clinique des animaux doit donc être particulièrement minutieuse, afin de fournir le maximum de renseignements possible. La méthode doit permettre de mettre en évidence les substances chimiques ayant un potentiel neurotoxique qui pourrait nécessiter d'autres études plus appronfondies. Il importe en outre d'étudier la capacité des substances à produire des effets neurotoxiques spécifiques qui ne seraient pas détectés par d'autres études de toxicité. Certaines substances organophosphorées, par exemple, ont une neurotoxicité différée que les méthodes B.37 et B.38 permettent d'évaluer, après administration unique ou administration répétée.
B.VI Immunotoxicité L'immunotoxicité peut se manifester de différentes façons, notamment par une immunosuppression et/ou un renforcement de la réponse immunitaire entraînant soit une hypersensibilité soit une auto-immunité induite. L'essai de toxicité par administration répétée, méthode B.7, comporte une évaluation des effets immunotoxiques. Cette méthode doit permettre de mettre en évidence les substances chimiques ayant un potentiel immunotoxique qui pourrait nécessiter d'autres études plus approfondies.
B.VII Toxicocinétique Les études toxicocinétiques facilitent l'interprétation et l'évaluation des données de toxicité. Elles ont pour objet d'élucider certains aspects particuliers de la toxicité de la substance chimique étudiée, et leurs résultats peuvent aider à concevoir d'autres études de toxicité. Il n'est pas envisagé de déterminer l'ensemble des paramètres dans tous les cas; la séquence complète des études toxicocinétiques (absorption, excrétion, distribution et métabolisme) n'est nécessaire que dans de rares cas. Pour certains composés, des modifications de cette séquence peuvent être souhaitables, ou une étude par administration unique peut s'avérer être suffisante (méthode B.36).
Les informations concernant la structure chimique (RSA) et les propriétés physico-chimiques peuvent également fournir des renseignements sur les caractéristiques d'absorption par la voie d'administration prévue, ainsi que sur les possibilités de transformation et de distribution dans les tissus. Des études de toxicité et des études toxicocinétiques antérieures peuvent aussi fournir des informations sur les paramètres toxicocinétiques.
C. CARACTERISATION DE LA SUBSTANCE A TESTER Avant d'entreprendre toute étude de toxicité, il faut connaître la composition de la substance à tester, y compris les principales impuretés, ainsi que ses propriétés physico-chimiques dont sa stabilité.
Les propriétés physico-chimiques de la substance fournissent des informations importantes pour le choix de la voie d'administration, pour la conception des différentes études, ainsi que pour la manipulation et le stockage de la substance.
La mise au point d'une méthode d'analyse permettant une évaluation qualitative et quantitative de la substance à tester (y compris, si possible, de ses principales impuretés) dans le véhicule d'administration et dans le matériel biologique doit précéder la mise en oeuvre de l'étude.
Toutes les informations concernant l'identification, les propriétés physico-chimiques, la pureté et le comportement de la substance à tester doivent être consignées dans le procès-verbal d'essai.
D. SOIN DES ANIMAUX Lors des essais de toxicité, il est essentiel de procéder à des contrôles stricts des conditions ambiantes et d'utiliser des techniques appropriées de soin des animaux. i) Conditions d'hébergement Les conditions ambiantes dans les locaux ou enceintes réservés aux animaux d'expérience doivent être adaptées à l'espèce utilisée pour l'essai.Pour les rats, les souris et les cobayes, la température ambiante doit être de 22° C + 3° C et l'humidité relative de 30 à 70 %; pour les lapins, la température doit être de 20° C + 3° C et l'humidité relative de 30 à 70 %.
Certaines techniques expérimentales sont particulièrement sensibles aux effets thermiques et dans de tels cas, des indications précises concernant les conditions adéquates figurent dans la description de la méthode d'essai. Dans tous les essais de toxicité, la température et l'humidité doivent être contrôlées et consignées, et doivent figurer dans le rapport final d'étude.
Un éclairage artificiel doit garantir l'alternance de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les détails concernant les conditions d'éclairage doivent être consignés dans le rapport final d'étude.
Sauf si la méthode prévoit d'autres conditions, les animaux doivent être hébergés individuellement ou mis en cage par petits groupes de même sexe. Les cages collectives ne doivent pas contenir plus de cinq animaux.
Il est important que les comptes rendus d'expérimentation animale précisent le type de cage utilisé et le nombre d'animaux par cage lors de l'exposition à la substance chimique et pendant toute période d'observation qui suit. ii) Conditions d'alimentation Le régime alimentaire doit répondre à tous les besoins nutritionnels de l'espèce soumise à l'expérience. Lorsque les substances à tester sont administrées dans la nourriture, il se peut que la valeur nutritionnelle de cette dernière soit amoindrie par une interaction entre la substance et un ingrédient de l'alimentation. Cette éventualité doit être prise en compte lors de l'interprétation des résultats de l'essai. Les régimes alimentaires classiquement utilisés en laboratoire sont acceptables, l'eau de boisson étant fournie à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être guidé par la nécessité de garantir une proportion appropriée de substance en cas d'administration par cette méthode.
Les contaminants alimentaires qui agissent sur la toxicité ne doivent pas être présents à des concentrations susceptibles d'influencer les résultats.
E. BIEN-ETRE DES ANIMAUX Le bien-être des animaux est dûment pris en compte lors de l'élaboration des méthodes d'essai. Quelques exemples sont brièvement cités ci-après, mais cette liste n'est pas exhaustive. Pour connaître les règles et/ou conditions exactes, il faut se référer à l'énoncé des méthodes. - Pour la détermination de la toxicité orale aiguë, deux méthodes sont envisageables : la « méthode des doses fixes » : et la « méthode de classe de toxicité aiguë » :. La méthode des doses fixes n'utilise pas la mort comme critère spécifique d'évaluation de la toxicité, et nécessite moins d'animaux. La méthode de la classe de toxicité aiguë utilise en moyenne 70 % d'animaux en moins que la méthode B.1 pour la toxicité orale aiguë. Ces deux méthodes entraînent moins de souffrances et de détresse que la méthode classique. - Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum scientifiquement acceptable : cinq animaux de même sexe seulement sont testés par dose pour les méthodes B.1 et B.3; 10 animaux seulement (et 5 seulement pour le groupe témoin négatif) sont utilisés pour déterminer la sensibilisation cutanée par la méthode de maximalisation chez le cobaye (méthode B.6); le nombre d'animaux nécessaires comme témoins positifs pour étudier la mutagénicité in vivo est également réduit (méthodes B.11 et B.12). - La souffrance et la détresse des animaux pendant les essais sont minimisées : les animaux présentant des signes de souffrance et de détresse intenses et persistantes pourront être euthanasiés; il n'est pas nécessaire d'administrer les substances connues pour provoquer une détresse et une souffrance intenses du fait des propriétés corrosives ou irritantes de la substances (méthodes B.1, B.2 et B.3). - Les essais limite évitent d'avoir à tester des doses inutilement élevées, tant pour les essais de toxicité aiguë (méthode B.1, B.2 et B.3) que pour les essais de mutagénicité in vivo (méthodes B.11 et B.12). - Une stratégie relative à la détermination des propriétés irritantes permet désormais de ne pas réaliser l'essai ou de le limiter à un seul animal lorsque des éléments scientifiques probants peuvent être fournis.
Ces éléments scientifiques peuvent être basés sur les propriétés physico-chimiques de la substance, sur les résultats d'autres essais antérieurs, ou sur les résultats d'essais in vitro dûment validés. Par exemple, si une substance a fait l'objet d'une étude de toxicité aiguë par exposition cutanée à la dose limite (méthode B.3) et qu'aucune irritation cutanée n'a été observée, il n'est peut être pas utile d'effectuer d'autres essais d'irritation cutanée (méthode B.4); les produits qui se sont révélés nettement corrosifs ou responsables d'une irritation cutanée grave à la suite d'une étude d'irritation cutanée (méthode B.4) ne doivent pas faire l'objet d'essais complémentaires d'irritation oculaire (méthode B.5).
F. METHODES ALTERNATIVES Un des objectifs scientifiques de l'Union européenne est de mettre au point et de valider des méthodes alternatives qui fournissent autant d'informations que les expérimentations animales actuelles, mais qui nécessitent moins d'animaux, minimisent leurs souffrances et permettent d'éviter leur sacrifice.
Dès que de telles méthodes sont disponibles, elles doivent être envisagées, chaque fois que cela est possible, pour la caractérisation des dangers et pour la classification et l'étiquetage des substances en fonction des dangers intrinsèques.
G. EVALUATION ET INTERPRETATION L'extrapolation directe à l'homme des résultats des expériences sur les animaux et des essais in vitro n'est possible que dans certaines limites; il faut en tenir compte lors de l'évaluation et de l'interprétation des essais; aussi, lorsque des effets indésirables ont été mis en évidence chez l'homme, ces données peuvent être utilisées pour confirmer les résultats expérimentaux.
Ces résultats sont utilisables pour la classification et l'étiquetage des produits chimiques nouveaux ou existants pour leurs effets sur la santé humaine sur la base de leurs propriétés intrinsèques mis en évidence et quantifiés par les méthodes préconisées. Les critères correspondants de classification et d'étiquetage figurant à l'annexe VI font également référence aux critères d'évaluation des protocoles d'essais de ces méthodes.
Ces résultats peuvent aussi être utilisés pour les études d'évaluation des risques des produits chimiques nouveaux ou existants, et des stratégies d'essai appropriées sont proposées dans les documents guides correspondants.
H. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES La plupart des méthodes présentées ici sont élaborées dans le cadre du programme de lignes directrices de l'OCDE en matière d'essais. Ces méthodes doivent être mises en oeuvre conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire, afin de garantir l'acceptation mutuelle des données.
De plus amples informations peuvent être obtenues dans les références citées dans les lignes directrices de l'OCDE et dans d'autres publications pertinentes. » Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe II B « B.1ter TOXICITE (ORALE) AIGU" - METHODE DE LA CLASSE DE TOXICITE AIGU" 1. METHODE 1.1. Introduction La méthode de la classe de toxicité aiguë fournit des informations à la fois pour l'évaluation des risques et pour la classification des substances.
La méthode utilise trois doses fixes suffisamment distinctes pour permettre la classification de la substance en fonction des résultats de l'étude. En outre, le protocole décrit permet de choisir trois doses supplémentaires qui peuvent être utilisées à certains stades de décision ou pour la poursuite de l'essai. L'utilisation d'une de ces doses supplémentaires peut être envisagée lorsqu'une analyse plus fine s'avère souhaitable ou nécessaire.
La méthode utilise des doses de départ définies; l'objectif n'est pas de calculer une DL50 précise, mais de déterminer une plage d'exposition susceptible d'entraîner la mort, puisque la mort d'une certaine proportion d'animaux reste le principal critère d'évaluation de cet essai. Les résultats de l'essai doivent permettre une classification selon les critères de l'annexe VI. Du fait de l'approche séquentielle, la durée de l'essai peut être supérieure à celle indiquée dans la méthode B.1. Le principal avantage de cette méthode est qu'elle nécessite moins d'animaux que la méthode de toxicité (orale) aiguë (B.1) et que la méthode alternative de la dose fixe (B.1bis).
Voir également l'introduction générale, partie B. 1.2. Définitions Voir introduction générale, partie B. 1.3. Principe de la méthode d'essai Une des doses prédéterminées de la substance est administrée oralement à un groupe d'animaux d'expérience. La substance est testée par étapes, chacune des étapes nécessitant trois animaux du même sexe. Il n'est pas nécessaire de procéder à une étude d'observation préliminaire. Selon qu'une mortalité liée à la substance est ou non constatée chez les animaux traités, l'essai se poursuivra comme suit : - l'essai ne sera pas poursuivi, - l'étape suivante sera réalisée à la même dose, mais sur des animaux de l'autre sexe, - l'étape suivante sera réalisée à la dose immédiatement supérieure ou immédiatement inférieure. 1.4. Description de la méthode d'essai 1.4.1. Préparation Des animaux adultes jeunes et sains sont sélectionnés au hasard, marqués pour permettre leur identification et maintenus dans leur cage pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai, afin de leur permettre de s'acclimater aux conditions régnant dans le laboratoire.
Les animaux peuvent être regroupés dans les cages par sexe et par dose, mais le nombre d'animaux par cage doit toujours permettre une observation aisée de chaque animal.
La substance à tester est administrée aux animaux en une seule fois, par gavage à l'aide d'une sonde oesophagienne ou d'une canule pour intubation appropriée.
Si nécessaire, la substance à tester est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. Chaque fois que possible, on utilisera de préférence une solution/suspension aqueuse, ou sinon une solution/émulsion dans l'huile (par exemple, huile de maïs) ou éventuellement une solution dans d'autres véhicules. Si le véhicule utilisé n'est pas aqueux, ses caractéristiques toxiques doivent être connues ou être déterminées avant l'essai.
Les animaux sont mis à la diète avant l'administration de la substance (la veille au soir pour le rat et pendant 3-4 heures pour la souris), mais sans les priver d'eau. 1.4.2. Conditions de l'essai 1.4.2.1. Animaux d'expérience Sauf indication contraire, le rat est l'espèce de prédilection en ce qui concerne les rongeurs. Les femelles doivent être nullipares et non gravides.
Au début de l'étude, l'écart de poids entre les animaux doit être minime et ne pas dépasser + 20 pour cent du poids moyen pour chaque sexe. 1.4.2.2. Nombre et sexe Trois animaux de même sexe sont utilisés pour chaque étape. Le choix du sexe est indifférent pour la première étape. 1.4.2.3. Doses La dose de départ à utiliser est choisie parmi l'une des trois doses fixes, à savoir 25, 200 et 2 000 mg/kg de poids corporel. La dose de départ doit être celle qui est la plus susceptible d'entraîner la mort d'au moins certains des animaux traités. En fonction de la dose de départ, on pourra utiliser un des modes opératoires représentés sous forme de diagrammes à l'annexe I. Pour sélectionner le sexe et la dose de départ, toutes les informations disponibles doivent être utilisées, y compris les données concernant la relation structure-activité. Lorsque les informations suggèrent qu'une mortalité est improbable à la dose la plus élevée (2 000 mg/kg p.c.), il y a lieu d'effectuer un essai de limite. En l'absence d'informations sur une substance à tester, il est recommandé, pour des motifs ayant trait au bien-être des animaux, d'utiliser la dose de départ de 200 mg/kg p.c.
Il peut être souhaitable d'obtenir des informations plus précises que celles fournies par l'essai aux trois doses fixes de 25, 200 et 2 000 mg/kg p.c. Dans ce cas, il est possible de poursuivre l'essai en utilisant des doses fixes supplémentaires de 5, 50 ou 500 mg/kg p.c.
Il n'est pas nécessaire d'administrer des doses dont on sait qu'elles entraîneront une souffrance et une détresse importantes, du fait des propriétés corrosives ou très irritantes de la substance.
Le laps de temps qui s'écoule entre le traitement des différents groupes est fonction de la date d'apparition, de la durée et de la gravité des signes de toxicité observés. Le traitement des animaux de l'autre sexe ou le traitement par la dose supérieure seront différés jusqu'à ce que l'on se soit assuré de la survie des animaux précédemment traités. 1.4.2.4. Essai limite Il est possible d'effectuer un essai limite à la dose de 2 000 mg/kg p.c. sur trois animaux de chaque sexe. Si l'on observe une mortalité due à la substance, il peut s'avérer nécessaire de poursuivre l'essai à la dose de 200 mg/kg p.c. (ou 500 mg/kg p.c.). 1.4.2.5. Période d'observation Les animaux sont normalement observés pendant 14 jours, à moins qu'ils ne meurent avant ou qu'il ne soit nécessaire de les exclure de l'étude et de les sacrifier par euthanasie pour abréger leurs souffrances. La durée de la période d'observation ne doit toutefois pas être fixée de façon rigide; elle doit être déterminée en fonction des effets toxiques, de leur date d'apparition et de la durée de la période de récupération, et peut donc être prolongée si nécessaire. Le moment où les signes de toxicité apparaissent et celui où ils disparaissent sont importants, en particulier si ces signes ont tendance à apparaître tardivement. Toutes les observations sont systématiquement consignées et une fiche individuelle est établie pour chaque animal. 1.4.3. Mode opératoire Après la période de jeûne, les animaux sont pesés préalablement à l'administration de la substance. Une fois la substance administrée, les animaux peuvent être privés de nourriture pendant une nouvelle période de 3-4 heures. Lorsqu'une dose est administrée en plusieurs fois sur une période donnée, il peut être nécessaire, suivant la durée de cette période, de nourrir et d'abreuver les animaux.
Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une seule fois dépend de la taille de l'animal d'expérience. Chez les rongeurs, ce volume ne doit normalement pas excéder 1 ml/100 g de poids corporel; toutefois, cette limite peut être portée à 2 ml/100 g de poids corporel dans le cas des solutions aqueuses. Pour minimiser la variabilité du volume d'essai, les concentrations doivent être adaptées de manière que toutes les doses soient administrées à volume constant. Si l'administration en une dose unique n'est pas possible, la dose peut être fractionnée en plusieurs prises sur une période ne dépassant pas 24 heures.
Le mode opératoire détaillé figure à l'annexe I. 1.4.3.1. Observation générale Une observation clinique détaillée doit être effectuée à deux reprises au moins le jour de l'administration ou davantage si la réaction des animaux le nécessite, et au moins une fois par jour par la suite. Les animaux retrouvés à l'état moribond et ceux qui présentent des signes de souffrance et de détresse intenses et persistants doivent être euthanasiés. Les animaux sacrifiés pour ces motifs sont pris en compte de la même façon que les animaux qui succombent au cours de l'essai.
Lorsque des animaux sont sacrifiés pour des raisons humanitaires ou sont retrouvés morts, le moment de leur mort doit être noté aussi précisément que possible. Des observations complémentaires sont nécessaires si les animaux continuent de présenter des signes de toxicité. Ces observations doivent porter sur les modifications de la peau et des poils, des yeux et des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Il convient d'être particulièrement attentifs aux manifestations telles que tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma.
Toutes les observations sont systématiquement consignées, et une fiche individuelle est établie pour chaque animal. 1.4.3.2. Poids corporel Tous les animaux doivent être pesés peu de temps avant l'administration de la substance à tester, et au moins une fois par semaine par la suite. Les variations du poids doivent être calculées et consignées. A la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés avant d'être euthanasiés. 1.4.3.3. Autopsie Tous les animaux d'expérience, y compris ceux qui sont morts pendant l'essai ou qui ont été retirés de l'étude, sont soumis à une autopsie.
Pour chaque animal, toutes les modifications pathologiques macroscopiques doivent être consignées. Un examen microscopique des organes présentant des signes de pathologie à l'examen macroscopique peut être envisagé pour les animaux ayant survécu au minimum 24 heures, car il peut fournir des informations utiles. 2. RESULTATS Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuellement.En outre, tous les résultats doivent être récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux utilisé, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux retrouvés morts au cours de l'essai ou sacrifiés pour des raisons humanitaires, le moment de la mort de chaque animal, la description des effets toxiques, leur période d'apparition et leur évolution, ainsi que les résultats de l'autopsie.
Des indications générales concernant l'interprétation des résultats en vue de la classification figurent à l'annexe 2. 3. COMPTE RENDU Procès-verbal d'essai Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants : Animaux d'expérience : - espèce/souche, - état des animaux, sur le plan microbiologique, si informations à ce sujet, - nombre d'animaux, âge et sexe, - origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc., - poids de chaque animal au début de l'essai, à intervalles d'une semaine par la suite et à la fin de l'essai.
Conditions expérimentales : - justification du choix du véhicule si autre que de l'eau, - détails concernant l'administration de la substance, y compris les volumes administrés et le moment de l'administration, - détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau (type/origine, origine de l'eau), - justification du choix de la dose de départ.
Résultats : - tableaux des résultats par sexe et par dose pour chaque animal (à savoir les animaux présentant des signes d'intoxication, mortalité comprise; nature, gravité et durée des effets), - date d'apparition des signes de toxicité, évolution dans le temps et réversibilité éventuelle, - résultats de l'autopsie et le cas échéant de l'examen histopathologique, pour chaque animal.
Discussion des résultats Conclusions 4. REFERENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 423 de l'OCDE. Annexe 1 MODE OPERATOIRE 1. Comme indiqué au paragraphe 1.4.2.3, la dose de départ doit être la dose susceptible d'entraîner une mortalité chez au moins certains des animaux traités. Les informations pouvant servir à sélectionner cette dose de départ sont les suivantes : - données relatives aux propriétés physico-chimiques, - relation structure-activité, - toutes les données résultant des autres essais de toxicité, - usage prévu de la substance à tester. 2. Pour chaque dose de départ, la procédure à suivre est indiquée par le programme d'essai correspondant figurant dans la présente annexe. En fonction du nombre d'animaux morts ou sacrifiés selon une méthode humaine, la procédure à suivre est indiquée par des flèches. 3. Lorsque l'administration d'une dose de départ de 25 ou de 200 mg/kg de poids corporel entraîne la mort d'un seul animal de l'autre sexe, l'essai n'a normalement pas à être poursuivi.Toutefois, si aucun signe de toxicité n'est observé sur les cinq autres animaux, il convient, au moment de l'autopsie, d'envisager la possibilité que le décès n'ait pas été causé par la substance. Dans ce cas, l'essai doit être poursuivi en utilisant la dose immédiatement supérieure. 4. Si l'administration d'une dose de 2 000 mg/kg de poids corporel entraîne la mort d'un animal de chaque sexe, il est probable que la DL50 soit supérieure à 2 000 mg/kg p.c. Toutefois, dans la mesure où il s'agit d'un résultat limite, il convient d'observer attentivement la réaction des deux autres animaux de chaque sexe car l'apparition de signes nets et marqués d'intoxication chez ces animaux pourrait aboutir à une classification correspondant à une DL50 inférieure ou égale à 2 000 mg/kg p.c. ou justifier la poursuite de l'essai à cette même dose. 5. La procédure permet d'effectuer l'essai en utilisant trois doses fixes supplémentaires (option 2).Cette option peut être utilisée pour sélectionner une autre dose à un moment donné, ou pour poursuivre les essais une fois l'essai en question terminé (option 1). L'option 1 est indiquée par des flèches épaisses, l'option 2 par des flèches fines.
Pour la consultation du tableau, voir image Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe II C « B.6 SENSIBILISATION CUTANEE 1. METHODE 1.1. Introduction Remarques : La sensibilité des essais et leur capacité à détecter les substances susceptibles d'entraîner une sensibilisation cutanée chez l'homme sont des critères importants dans un système de classification de la toxicité établi à des fins de santé publique.
Il n'existe pas de méthode d'essai unique qui permette d'identifier de manière adéquate toutes les substances ayant un potentiel de sensibilisation cutanée pour l'homme et qui puisse être appliquée à toutes les substances.
Divers facteurs tels que les caractéristiques physiques d'une substance, y compris son pouvoir de pénétration cutanée, doivent être pris en considération lors du choix de l'essai.
Deux types d'essai utilisant des cobayes ont été développés : d'une part, les essais avec adjuvant dans lesquels l'état est potentialisé par la dissolution ou la mise en suspension dans de l'adjuvant complet de Freund (ACF) de la substance à tester, et d'autre part les essais sans adjuvant.
Les essais avec adjuvant ont généralement un meilleur pouvoir prédictif du potentiel sensibilisant cutané de la substance testée avec plus de précision que les méthodes qui n'utilisent pas l'adjuvant complet de Freund. C'est la raison pour laquelle leur utilisation est préférable.
L'essai de maximalisation chez le cobaye (GPMT : Guinea Pig Maximisation Test) est un essai avec adjuvant très répandu. Bien qu'il existe plusieurs autres méthodes pour détecter le potentiel de sensibilisation cutanée, le GPMT est l'essai avec adjuvant de prédilection.
Les essais sans adjuvant (l'essai de Buehler étant préférable) sont considérés comme moins sensibles vis-à-vis de nombreuses classes de produits chimiques.
Dans certains cas, l'essai de Buehler qui consiste en une application topique, peut s'avérer préférable à l'essai de maximalisation qui nécessite une injection intradermique. L'utilisation de l'essai de Buehler doit être scientifiquement justifiée.
L'essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT) et l'essai de Buehler sont décrits dans cette méthode. D'autres méthodes peuvent être utilisées, à condition qu'elles soient correctement validées et que leur utilisation soit scientifiquement justifiée.
Si un résultat positif est obtenu dans un test de dépistage reconnu, une substance peut être considéré comme un sensibilisant potentiel et il peut ne pas être nécessaire de réaliser un essai complémentaire sur le cobaye. Cependant si un résultat négatif est obtenu dans un tel test de dépistage, un essai sur le cobaye doit être effectué en utilisant la procédure décrite dans la présente méthode d'essai.
Voir également introduction générale, partie B. 1.2. Définitions La sensibilisation cutanée (dermite allergique de contact) est une réaction immunologique cutanée à une substance. Chez l'homme, la réaction peut se caractériser par un prurit, un érythème, un oedème, des vésicules, des bulles ou une association de ces manifestations.
Dans les autres espèces, la réaction peut différer et prendre uniquement la forme d'un érythème ou d'un oedème.
Exposition d'induction : exposition expérimentale d'un sujet à une substance dans le but d'induire une hypersensibilité.
Période d'induction : période d'au moins une semaine consécutive à l'exposition d'induction, au cours de laquelle une hypersensibilité peut s'installer.
Exposition de déclenchement : exposition expérimentale, après période d'induction, d'un sujet préalablement exposé à la substance, dans le but de vérifier si le sujet présente une réaction d'hypersensibilité. 1.3. Substances de référence La sensibilité et la fiabilité de la technique expérimentale utilisée doivent être vérifiées tous les six mois à l'aide de substances ayant des propriétés connues de sensibilisation cutanée faible à modérée.
Pour un essai conduit selon les règles, les substances faiblement ou moyennement sensibilisantes provoquent normalement une réaction d'au moins 30 % dans les méthodes avec adjuvant et 15 % dans les méthodes sans adjuvant.
Les substances suivantes seront de préférence utilisées : Pour la consultation du tableau, voir image Dans certaines circonstances dûment justifiées, il est possible d'utiliser d'autres substances répondant aux critères ci-dessus. 1.4. Principe de la méthode d'essai Les animaux d'expérience sont dans un premier temps exposés à la substance à tester par une injection intradermique et/ou une application épidermique (exposition d'induction). Après une période de repos de 10 à 14 jours (période d'induction) au cours de laquelle une réaction immunitaire peut se produire, les animaux sont exposés à une dose de déclenchement. L'étendue et le degré de la réaction cutanée des animaux sont alors comparées à celles de la réaction observée chez les animaux témoins qui ont reçu un placebo lors de l'induction et qui ont été soumis à l'exposition de déclenchement. 1.5. Description des méthodes d'essai Si l'élimination de la substance à tester s'avère nécessaire, ceci doit être fait en utilisant de l'eau ou un solvant approprié afin de ne pas modifier la réaction existante ou l'intégrité de l'épiderme. 1.5.1. Essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT) 1.5.1.1. Préparation De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai.
Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et lots témoins. Les poils sont tondus, rasés ou épilés chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas érafler la peau.
Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai. 1.5.1.2. Conditions de l'essai 1.5.1.2.1. Animaux d'expérience Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire. 1.5.1.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides.
Le lot traité comprend au minimum 10 animaux et le lot témoin, au moins 5. Si le lot traité comprend moins de 20 animaux et le lot témoin moins de 10, et qu'il n'est pas possible de conclure que la substance à tester est un agent sensibilisant. Dans ce cas, il est fortement recommandé d'utiliser d'autres animaux afin d'arriver à un total d'au moins 20 animaux d'essai et 10 animaux témoins. 1.5.1.2.3. Doses La concentration de substance utilisée pour chaque exposition d'induction doit être bien tolérée par l'organisme des animaux et doit correspondre à la concentration maximale entraînant une irritation cutanée légère à modérée. La concentration utilisée pour l'exposition de déclenchement doit correspondre à la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appropriées peuvent être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois animaux. A cet effet, il convient d'utiliser des animaux traités par l'adjuvant complet de Freund. 1.5.1.3. Mode opératoire 1.5.1.3.1. Induction Jour 0 - lot traité Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml chacune sont pratiquées dans la région scapulaire préalablement débarrassée de ses poils, de part et d'autre de la ligne médiane.
Injection 1 : mélange 1 :1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique Injection 2 : la substance à tester dans un véhicule adéquat, à la concentration sélectionnée Injection 3 : la substance à tester à la concentration voulue, mélangée dans un rapport 1 :1 (v/v) à de l'adjuvant complet de Freund ou du sérum physiologique.
Pour l'injection 3, les substances hydrosolubles sont dissoutes dans la phase aqueuse avant d'être mélangées avec l'adjuvant complet de Freund. Les substances liposolubles ou insolubles sont d'abord mises en suspension dans l'adjuvant complet de Freund, puis mises en phase aqueuse. La concentration finale de la substante à tester doit être égale à celle utilisée pour l'injection 2.
Les injections 1 et 2 sont pratiquées à proximité l'une de l'autre et le plus près possible de la tête, tandis que l'injection 3 est effectuée vers la partie caudale de la zone d'essai.
Jour 0 - lot témoin Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml chacune sont réalisées aux mêmes endroits que chez les animaux traités.
Injection 1 : mélange 1 :1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique Injection 2 : le véhicule non dilué Injection 3 : formulation à 50 % du véhicule dans un mélange 1 :1 d'adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique. 5ème - 7ème jour - lot traité et lot témoin Environ 24 heures avant l'application topique d'induction et si la substance ne provoque pas d'irritation cutanée, la zone d'essai rasée et/ou tondue est badigeonnée avec 0,5 ml de lauryl sulfate de sodium à 10 % dans de la vaseline, afin de créer une irritation locale. 6ème - 8ème jour - lot traité La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Un papier filtre (2 x 4 cm) imprégné de la substance dans le véhicule approprié est appliqué sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau à l'aide d'un pansement occlusif pendant 48 heures. Le choix du véhicule doit être justifié. Les substances solides sont réduites en poudre fine et incorporées dans un véhicule approprié; les substances liquides peuvent éventuellement être appliquées directement. 6ème - 8ème jour - lot témoin La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Le véhicule seul est appliqué comme indiqué précédemment sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau pendant 48 heures à l'aide d'un pansement occlusif. 1.5.1.3.2. Déclenchement 20ème - 22ème jour - lot traité et lot témoin Les flancs des animaux traités et des animaux témoins sont débarrassés de leurs poils. Un patch ou une cupule chargés de la substance à tester est appliqué sur un des flancs des animaux et, s'il y a lieu, un patch ou une cupule imprégnés uniquement du véhicule est appliqué sur l'autre flanc. Les pastilles sont maintenues en contact avec la peau pendant 24 heures à l'aide d'un pansement occlusif. 1.5.1.3.3. Observation et cotation : lot traité et lot témoin - Environ 21 heures après le retrait de la pastille, la zone étudiée est nettoyée et rasée et/ou tondue et épilée si nécessaire; - 3 heures plus tard environ (à peu près 48 heures après le début de l'application de déclenchement), la réaction cutanée est observée et cotée d'après l'échelle indiquée en annexe; - environ 24 heures après cette observation, on procède à une seconde observation (72 heures) et à une nouvelle cotation.
Il est recommandé de procéder à une lecture en aveugle chez les animaux traités et les animaux témoins.
S'il est nécessaire de préciser les résultats obtenus lors de la première exposition de déclenchement, une seconde exposition de déclenchement (c.-à-d. redéclenchement), si nécessaire avec un nouveau lot témoin, sera envisagée environ une semaine après la première exposition. La nouvelle exposition de déclenchement peut également être effectuée sur le lot témoin initial.
Toutes les réactions cutanées et toutes les observations inhabituelles, y compris les réactions systémiques, résultant d'une exposition d'induction ou de déclenchement, doivent être observées et cotées d'après l'échelle de Magnusson/Kligman (voir annexe). D'autres techniques telles qu'un examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané peuvent être utilisées pour préciser les réactions douteuses. 1.5.2. Essai de Buehler 1.5.2.1. Préparation De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai.
Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et lots témoins. Les poils sont coupés, rasés ou éventuellement épilés chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas érafler la peau. Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai. 1.5.2.2. Conditions de l'essai 1.5.2.2.1. Animaux d'expérience Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire. 1.5.2.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides.
Le lot traité comprend au minimum 20 animaux et le lot témoin, au moins 10. 1.5.2.2.3. Doses Pour chaque exposition d'induction, la concentration de substance à utiliser est la concentration maximale entraînant une irritation modérée mais non excessive. Pour l'exposition de déclenchement, la concentration à utiliser est la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appropriées peuvent être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois animaux.
Pour les substances hydrosolubles, il convient d'utiliser comme véhicule de l'eau ou une solution diluée non irritante de surfactant.
Pour les autres substances, il est préférable d'utiliser un mélange d'éthanol à 80 % dans de l'eau pour l'induction, et de l'acétone pour le déclenchement. 1.5.2.3. Mode opératoire 1.5.2.3.1. Induction Jour 0 - lot traité Un des flancs des animaux est rasé. La compresse servant à réaliser le test est imprégnée de la substance à tester incorporée dans un véhicule approprié (le choix du véhicule doit être justifié; les substances liquides peuvent au besoin être appliquées directement). La compresse est appliquée sur la zone d'essai et maintenue en contact avec la peau pendant 6 heures à l'aide d'un pansement occlusif ou d'une cupule et d'un pansement approprié.
Le système doit être occlusif. Un tampon de ouate rond ou carré de 4 à 6 cm2 convient. Il est préférable d'utiliser un dispositif de contention approprié pour garantir l'occlusion. Si l'on utilise des bandages, des expositions supplémentaires peuvent s'avérer nécessaires.
Jour 0 - lot témoin Un des flancs des animaux est rasé. Le véhicule seul est appliqué de la façon décrite pour les animaux traités. La compresse servant à réaliser le test est maintenue en contact avec la peau pendant 6 heures à l'aide d'un pansement occlusif ou d'une cupule et d'un pansement approprié. S'il peut être prouvé qu'il n'est pas nécessaire de simuler le traitement sur le lot témoin, cette étape peut être omise, un contrôle ne recevant rien peut être utilisé. 6ème - 8ème jour et 13ème - 15ème jour - lot traité et lot témoin La même application que celle décrite au jour 0 est réalisée sur la même zone (débarrassée de ses poils si nécessaire) du même flanc au 6ème - 8ème jour, puis à nouveau au 13ème - 15ème jour. 1.5.2.3.2. Déclenchement 27ème - 29ème jour - lot traité et lot témoin Le flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin est rasé. Une compresse occlusive ou une cupule contenant la quantité appropriée de la substance à tester, à la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation, est appliquée sur la partie postérieure du flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin.
S'il y a lieu, on appliquera également une compresse occlusive ou une cupule ne contenant que le véhicule sur la partie antérieure du flanc non traité des animaux du lot traité et du lot témoin. Les compresses ou cupules sont maintenues en contact avec la peau à l'aide d'un pansement approprié pendant 6 heures. 1.5.2.3.3. Observations et cotation - Environ 21 heures après le retrait de la compresse, la zone d'essai est débarrassée de ses poils; - environ trois heures plus tard (à peu près 30 heures après le début de l'exposition de déclenchement), la réaction cutanée est observée et cotée d'après l'échelle indiquée en annexe; - environ 24 heures après cette observation (soit environ 54 heures après l'exposition de déclenchement), la réaction cutanée est à nouveau observée et cotée.
Il est recommandé d'effectuer une lecture en aveugle de la réaction dans le lot traité et le lot témoin.
S'il est nécessaire de préciser les résultats obtenus lors de la première exposition de déclenchement, une seconde exposition de déclenchement, si nécessaire avec un nouveau lot témoin, sera envisagée environ une semaine après la première exposition. La nouvelle exposition de déclenchement peut également être effectuée sur le lot témoin initial.
Toutes les réactions cutanées et toutes les observations inhabituelles, y compris les réactions systémiques, résultant d'une exposition d'induction ou de déclenchement (c.-à-d. de redéclenchement), doivent être consignées et cotées d'après l'échelle de Magnusson/Kligman (voir annexe). D'autres techniques telles qu'un examen histopathologique ou la mesure de l'épaisseur du pli cutané peuvent être utilisées pour préciser les réactions douteuses. 2. RESULTATS (GMPT ET ESSAI DE BUEHLER) Les résultats sont récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque animal, la réaction cutanée lors de chaque observation.3. COMPTE RENDU (GMPT ET ESSAI DE BUEHLER) Lorsqu'un test de dépistage (p.ex. essai local sur ganglions lymphatiques (LLNA), essai de gonflement de l'oreille de souris (MEST)), est effectué préalablement à l'essai sur le cobaye, il convient d'en fournir la description ou la référence, ainsi que les détails du mode opératoire et les résultats obtenus avec la substance à tester et les substances de référence.
Procès-verbal d'essai (GMPT et essai de Buehler) Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants : Animaux d'expérience : - souche de cobayes utilisée, - nombre, âge et sexe des animaux, - origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc., - poids de chaque animal au début de l'essai.
Conditions expérimentales : - technique de préparation du site d'application, - détails sur les matériaux utilisés pour l'application et la technique d'application, - résultats de l'étude pilote et conclusions concernant les concentrations d'induction et de déclenchement à utiliser dans l'essai, - détails concernant la préparation, l'application et l'élimination de la substance à tester, - justification du choix du véhicule, - concentrations du véhicule et de la substance à tester utilisées pour les expositions d'induction et de déclenchement, et quantité totale de substance appliquée pour l'induction et le déclenchement.
Résultats : - résumé des résultats du dernier contrôle de sensibilité et de fiabilité (voir 1.3), y compris informations sur la substance, la concentration et le véhicule utilisés, - toute observation effectuée sur chaque animal, cotations comprises, - description de la nature et de la gravité des effets observés, - toute observation histopathologique.
Discussion des résultats Conclusions 4. REFERENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 406 de l'OCDE. Appendice TABLEAU : échelle de Magnusson et Kligman pour la cotation des réactions cutanées à une exposition de déclenchement 0 = pas de modification apparente 1 = érythème discret ou localisé 2 = érythème modéré et confluent 3 = érythème intense avec gonflement » Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe II D « B.7 TOXICITE (ORALE) PAR ADMINISTRATION REPETEE (28 JOURS) 1. METHODE 1.1. Introduction Voir introduction générale, partie B. 1.2. Définitions Voir introduction générale, partie B. 1.3. Principe de la méthode d'essai La substance à tester est administrée quotidiennement, par voie orale, à doses croissantes, à plusieurs lots d'animaux d'expérience, à raison d'une dose par lot pendant 28 jours. Pendant la période d'administration, les animaux sont observés attentivement chaque jour pour déceler les éventuels signes de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifiés en cours d'expérience ainsi que ceux qui survivent jusqu'à la fin de l'essai sont autopsiés.
Cette méthode insiste davantage sur les effets neurologiques; les observations cliniques doivent être effectuées avec grand soin pour obtenir le maximum d'informations possible. La méthode vise à identifier les produits chimiques ayant un potentiel neurotoxique qui pourrait nécessiter des études plus approfondies. En outre, cette méthode peut fournir des indications sur les effets immunologiques et sur la toxicité de la substance pour les organes de la reproduction. 1.4. Description de la méthode d'essai 1.4.1. Préparation De jeunes animaux adultes, sains, sont répartis au hasard en lots traités et lots témoins. Les cages seront disposées de façon à minimiser les éventuels effets dus à l'emplacement des cages. Les animaux sont identifiés individuellement et maintenus dans leur cage pendant au moins cinq jours avant le début de l'étude, pour leur permettre de s'acclimater aux conditions régnant dans le laboratoire.
La substance à tester est administrée par gavage ou dans l'alimentation ou l'eau de boisson. La méthode d'administration orale dépend du but de l'étude et des propriétés physico-chimiques de la substance.
Si nécessaire, la substance à tester est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. Chaque fois que possible, on utilisera plutôt une solution/suspension aqueuse, ou sinon une solution/émulsion huileuse (par exemple huile de maïs) et en dernier lieu d'autres véhicules. Si le véhicule utilisé n'est pas de l'eau, ses caractéristiques toxiques doivent être connues. Il convient de déterminer la stabilité de la substance à tester dans le véhicule. 1.4.2. Conditions de l'essai 1.4.2.1. Animaux d'expérience Les expériences sont de préférence effectuées sur le rat, mais d'autres espèces de rongeurs peuvent être utilisées. Les animaux adultes jeunes et sains sont issus de souches couramment utilisées en laboratoires. Les femelles doivent être nullipares et non gravides.
L'administration de la substance doit débuter le plus tôt possible après le sevrage, et dans tous les cas, avant que les animaux aient atteint l'âge de neuf semaines.
Au début de l'étude, l'écart de poids entre les animaux doit être minime et ne doit pas dépasser - 20 % du poids moyen de chaque sexe.
Lorsqu'une étude par administration orale répétée est effectuée préalablement à une étude à long terme, il est préférable d'utiliser des animaux de même souche et de même origine pour les deux études. 1.4.2.2. Nombre et sexe Dix animaux au moins (5 femelles et 5 mâles) sont utilisés pour chaque dose. Si le protocole expérimental prévoit des sacrifices en cours d'étude, le nombre d'animaux doit être augmenté du nombre de sacrifices prévus.
En outre, un lot satellite de 10 animaux (cinq de chaque sexe) peut être traité à la dose la plus élevée pendant 28 jours et placé en observation pendant 14 jours après l'arrêt du traitement pour étudier la réversibilité, la persistance ou l'apparition tardive des effets toxiques. Un lot satellite de 10 animaux témoins est également utilisé. 1.4.2.3. Niveau des doses On utilise en général au moins trois lots d'essai et un lot témoin. A l'exception de la substance à tester, les animaux du lot témoin reçoivent le même traitement que les animaux des lots traités. Si un véhicule est utilisé pour administrer la substance à tester, le volume maximal de ce véhicule sera administré au lot témoin.
S'il ressort de l'évaluation d'autres données que l'administration d'une dose de 1 000 mg/kg./j ne devrait pas entraîner d'effets, il est possible d'effectuer un essai de limite. En l'absence de données pertinentes, on peut procéder à une étude exploratoire pour aider à déterminer les doses à utiliser.
Les doses doivent être choisies en tenant compte de toutes les données disponibles concernant la toxicité et les aspects toxico-cinétiques de la substance à tester ou des substances de structure analogue. La dose la plus élevée doit produire des effets toxiques sans entraîner la mort ni des souffrances intenses. Une série de doses décroissantes est ensuite choisie, dans le but de mettre en évidence une relation entre la réaction et la dose administrée et d'objectiver une absence d'effets adverses à la dose la plus faible (dose sans effet adverse observé). L'écart optimal entre deux doses est souvent un facteur 2 à 4; il est préférable de prévoir une quatrième dose plutôt que d'avoir un écart excessif entre deux doses (plus qu'un facteur 10).
Pour les substances qui sont administrées dans l'alimentation ou dans l'eau de boisson, il est important de vérifier que les quantités de substance d'essai administrées n'interfèrent pas sur la nutrition normale et l'équilibre hydrique. Si la substance est administrée dans l'alimentation, on peut utiliser une concentration alimentaire constante (ppm) ou une dose constante par rapport au poids de l'animal; la solution choisie doit être précisée. Si la substance est administrée par gavage, la dose doit être administrée chaque jour à heure fixe et si nécessaire ajustée pour rester constante par rapport au poids de l'animal.
Lorsqu'une étude par administration orale répétée est effectuée préalablement à une étude à long terme, le régime alimentaire doit être identique dans les deux études. 1.4.2.4. Essai limite Lorsqu'un essai réalisé selon les méthodes décrites dans la présente étude, à une dose d'au moins 1 000 mg/kg poids corporel/jour, ou en cas d'administration dans l'alimentation ou l'eau de boisson, à une concentration équivalente (en fonction du poids corporel), ne produit pas d'effets toxiques observables et que les données relatives à des substances de structure apparentée ne laissent pas présumer une toxicité, il peut s'avérer inutile d'effectuer une étude complète sur trois doses. Dans ce cas, un essai limite se justifie, sauf si l'exposition humaine fait apparaître la nécessité d'utiliser une dose plus élevée. 1.4.2.5. Période d'observation La période d'observation dure 28 jours. Les animaux des lots satellites prévus pour des observations complémentaires seront maintenus en observation, sans aucun traitement, pendant 14 jours supplémentaires au moins, afin de détecter l'apparition retardée, la persistance ou la réversibilité des effets toxiques. 1.4.3. Mode opératoire La substance à tester est administrée aux animaux sept jours sur sept pendant 28 jours. Si la substance n'est administrée qu'à raison de cinq jours par semaine, ce choix doit être justifié. En cas d'administration par gavage, la dose doit être administrée en une fois à l'aide d'une sonde oesophagienne ou d'une canule à intubation appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l'animal. Ce volume ne doit pas excéder 1 ml/100 g de poids corporel, mais peut atteindre 2 ml/100 g de poids corporel lorsqu'il s'agit de solutions aqueuses. Sauf en ce qui concerne les substances irritantes ou corrosives pour lesquelles une augmentation de la concentration entraînerait des effets exacerbés, la variabilité des volumes d'essai doit être minimisée par un ajustement des concentrations, afin que le volume reste constant quelle que soit la dose. 1.4.3.1. Observation générale L'observation clinique générale doit être effectuée au moins une fois par jour, de préférence au(x) même(s) moment(s) de la journée, en fonction de la période post-administration où les effets sont les plus marqués. L'état de santé des animaux doit être consigné. Au moins deux fois par jour, tous les animaux sont examinés pour déterminer la morbidité et la mortalité. Les animaux moribonds ou présentant des signes de détresse ou de souffrance intenses sont immédiatement retirés, euthanasiés et autopsiés.
Tous les animaux sont soumis à une observation clinique détaillée une fois avant la première exposition (pour permettre des comparaisons sur un même sujet) et au moins une fois par semaine par la suite. Ces observations doivent être effectuées sur les animaux sortis de leur cage et placés dans une enceinte standard, et doivent de préférence avoir lieu toujours au même moment. Les observations doivent être soigneusement consignées, de préférence à l'aide de systèmes de notation explicitement définis par le laboratoire d'essai. Il convient de veiller à ce que les conditions expérimentales varient le moins possible, il est souhaitable que les personnes qui effectuent les observations ne soient pas informées du traitement administré. Les observations doivent porter, entre autres, sur les modifications de la peau, du poil, des yeux, des muqueuses, des sécrétions et excrétions et de l'activité autonome (par exemple larmoiement, hérissement du poil, respiration inhabituelle). Il convient également de noter tout changement de comportement, de posture ou de réaction à la manipulation, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, comportements stéréotypés (par exemple, toilettage excessif, animaux qui tournent en rond de façon répétitive) ainsi que tout comportement bizarre (auto-mutilation, marche à reculons).
Au cours de la quatrième semaine d'exposition, la réactivité aux différents stimuli sensoriels (auditifs, visuels et proprioceptifs), ainsi que la force de préhension et l'activité motrice sont évaluées.
Les méthodes utilisables à cet effet sont détaillées dans les publications de référence (voir introduction générale, partie B).
Les observations fonctionnelles de la quatrième semaine d'exposition peuvent être omises si l'étude est effectuée préalablement à une étude subchronique (sur 90 jours). Dans ce cas, les observations fonctionnelles doivent faire partie de l'étude complémentaire. En revanche, l'existence de données résultant des observations fonctionnelles effectuées lors de l'étude préliminaire par administration réitérée peut faciliter le choix des doses pour l'étude subchronique complémentaire.
Exceptionnellement, les observations fonctionnelles peuvent également être omises pour les lots qui montrent des signes de toxicité tels que les examens fonctionnels perdraient de leur valeur. 1.4.3.2. Poids corporel et consommation de nourriture et d'eau Tous les animaux doivent être pesés au moins une fois par semaine. La consommation d'aliments et d'eau doit être mesurée au minimum une fois par semaine. Si la substance est administrée dans l'eau de boisson, la consommation d'eau doit également être mesurée une fois par semaine au minimum. 1.4.3.3. Hématologie Les examens hématologiques suivants doivent être réalisés à la fin de la période d'essai : hématocrite, concentration en hémoglobine, numération des hématies et des leucocytes et formule leucocytaire, numération des plaquettes et mesure du temps/potentiel de coagulation.
Les échantillons de sang doivent être prélevés en un point déterminé, juste avant ou pendant le sacrifice des animaux, et conservés dans des conditions appropriées. 1.4.3.4. Biochimie clinique Des analyses biochimiques cliniques visant à étudier les principaux effets toxiques sur les tissus et en particulier sur le foie et les reins doivent être effectuées sur les échantillons de sang prélevés sur tous les animaux juste avant ou pendant le sacrifice (à l'exception des animaux retrouvés moribonds ou sacrifiés en cours d'essai). Il est préférable que les animaux soient à jeun depuis la veille (1). Ces déterminations effectuées dans le sérum ou le plasma concernent notamment le sodium, le potassium, le glucose, le cholestérol total, l'urée, le créatinine, les protéines totales et l'albumine, et au moins deux enzymes révélatrices des effets hépatocellulaires (telles que l'alanine, aminotransférase, l'aspartate aminotransférase, la phosphatase alcaline, la gamma-glutamyl transpeptidase et la sorbitol-deshydrogénase). La détermination d'autres enzymes (d'origine hépatique ou autre) ainsi que des acides biliaires peut dans certains cas fournir des informations utiles.
Eventuellement, des analyses d'urine peuvent être effectuées au cours de la dernière semaine de l'étude, comprenant un recueil du volume urinaire en un temps donné : aspect, volume, osmolalité ou densité, pH, protéines, glucose, de sang ou de cellules sanguines.
En outre, des études portant sur les marqueurs sériques des lésions tissulaires doivent être considérées. Les autres déterminations éventuellement nécessaires lorsque les propriétés de la substance à tester sont susceptibles de modifier les profils métaboliques concernant le calcium, le phosphate, les triglycérides à jeun, les hormones spécifiques, le méthémoglobine et la cholinestérase. Ces analyses devront être effectuées systématiquement pour les substances appartenant à certaines classes et au cas par cas pour les autres.
Dans l'ensemble, la démarche adoptée doit être souple et pouvoir être adaptée en fonction de l'espèce utilisée et des effets observés et/ou prévisibles de la substance considérée.
Si les données historiques de base recueillies antérieurement sont insuffisantes, les paramètres hématologiques et biochimiques devront être déterminés avant le début de l'expérience. 1.4.3.5. Autopsie Tous les animaux de l'étude doivent faire l'objet d'une autopsie détaillée comportant un examen approfondi de la surface externe du corps, de tous les orifices ainsi que des cavités crânienne, thoracique et abdominale et de leur contenu. Le foie, les reins, les glandes surrénales, les testicules, les épididymes, le thymus, la rate, le cerveau et le coeur de tous les animaux seront débarrassés de tous les tissus adhérents et pesés le plus rapidement possible pour éviter le dessèchement.
Les tissus ci-après seront conservés dans le milieu de fixation le plus approprié en fonction du type de tissu et des examens histopathologiques prévus : tout tissu présentant des lésions macroscopiques, l'encéphale (régions représentatives : cerveau, cervelet et protubérance annulaire), la moelle épinière, l'estomac, le colon et l'intestin grêle (y compris plaques de Peyer), le foie, les reins, les surrénales, la rate, le coeur, le thymus, la thyroïde, la trachée et les poumons (conservés par insufflation d'un fixateur et immersion), les gonades, les organes génitaux annexes (par exemple : utérus, prostate), la vessie, les ganglions lymphatiques (de préférence un ganglion sur le trajet de la voie d'administration et un autre à distance pour couvrir les effets systématiques), nerfs périphériques (sciatique ou tibial) de préférence très près du muscle, et une coupe de moelle osseuse (ou lame fraîchement montée de moelle recueillie par aspiration). En fonction des observations cliniques et des autres résultats, il peut s'avérer nécessaire d'examiner d'autres tissus. Tous les organes considérés comme organes cibles potentiels du fait des propriétés de la substance doivent également être conservés. 1.4.3.6. Examen histopathologique Pour tous les animaux du lot témoin et du lot traité à la dose la plus élevée, il est pratiqué un examen histopathologique complet des organes et tissus conservés. Cet examen devra être pratiqué pour tous les lots exposés à des doses inférieures si des modifications induites par la substance à tester sont observées chez les animaux du lot traité à la dose la plus élevée.
Toutes les lésions macroscopiques doivent être examinées.
Lorsqu'un lot satellite est utilisé, un examen histopathologique doit être pratiqué sur les organes et tissus sur lesquels des effets ont été observés dans les lots traités. 2. RESULTATS Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuellement.En outre, tous les résultats doivent être récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux utilisé, le nombre d'animaux retrouvés morts au cours de l'essai ou sacrifiés pour des raisons humanitaires, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité ainsi qu'une description de ces signes, le moment d'apparition, leur durée et leur gravité, le nombre d'animaux présentant des lésions, le type de lésion et le pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion.
Si possible, les résultats numériques seront évalués au moyen d'une méthode statistique appropriée et reconnue. La méthode statistique doit être choisie lors de la conception de l'étude. 3. COMPTE RENDU Procès-verbal d'essai Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les informations suivantes : Animaux d'expérience : - espèce/souche utilisée, - nombre d'animaux, âge et sexe, - origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc., - poids de chaque animal au début de l'essai, à intervalles d'une semaine par la suite et à la fin de l'essai.
Conditions expérimentales : - justification du choix du véhicule si autre que de l'eau, - justification du choix de la dose, - détails concernant la formulation/préparation de la substance, la concentration obtenue, la stabilité et l'homogénéité de la préparation, - détails concernant l'administration de la substance, - le cas échéant, conversion de la concentration de la substance dans la ration alimentaire/l'eau de boisson (ppm) en dose effective (mg/kg p.c./jour), - détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau.
Résultats : - poids corporel/modifications du poids corporel, - consommation d'aliments et, le cas échéant, consommation d'eau, - réponse toxique par sexe et par dose, signes de toxicité compris, - nature, gravité et durée des effets cliniques observés (réversibilité éventuelle), - évaluation de l'activité sensorielle, de la force de préhension et de l'activité motrice, - tests hématologiques et valeurs de référence applicables, - tests de biochimie clinique et valeurs de référence applicables, - poids corporel au moment du sacrifice et poids des organes, - résultats de l'autopsie, - description détaillée de tous les résultats de l'examen histopathologique, - données relatives à l'absorption si disponibles, - le cas échéant, traitement statistique des résultats.
Discussion des résultats Conclusions 4. REFERENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 407 de l'OCDE.» Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe II E « B.37 NEUROTOXICITE RETARDEE DES SUBSTANCES ORGANOPHOSPOREES APRES EXPOSITION AIGU" 1. METHODE 1.1. Introduction Lorsqu'on évalue les effets toxiques des substances, il est important d'étudier la capacité qu'ont certaines substances à entraîner certains types de neurotoxicité que les autres études de toxicité pourraient ne pas mettre en évidence. Certains composés organophosphorés ont une neurotoxicité différée et doivent faire l'objet de telles études.
Des essais de dépistage in vitro peuvent être utilisés pour identifier les substances susceptibles d'entraîner une polyneuropathie différée; toutefois, des résultats négatifs à l'issue d'essais in vitro ne suffisent pas à prouver que la substance testée n'est pas neurotoxique.
Voir introduction générale, partie B. 1.2. Définitions Les substances organophosphorées comprennent les esters, thioesters organophosphorés non chargés ou anhydrides des acides organophosphoriques, organophosphoniques ou organophosphoramidiques ou des acides phosphorothioïques, phosphonothioïques ou phosphorothioamidiques apparentés ou d'autres substances pouvant entraîner la neurotoxicité différée parfois observée pour les substances de cette classe.
La neurotoxicité retardée est un syndrome associé à l'installation prolongée et d'ataxie retardée, associée à des axonopathies distales au niveau de la moelle épinière et des nerfs périphériques, et à une inhibition et un vieillissement de l'estérase caractéristique des neuropathies (neuropathy taret esterase - NTE) dans les tissus nerveux. 1.3. Substances de référence Une substance de référence peut être testée sur un lot témoin positif, afin de démontrer que, dans les conditions de l'essai, la réaction de l'espèce testée n'est pas modifiée de façon significative.
Le tri-o-tolyl phosphate est un exemple de produit neurotoxique couramment utilisé (no CAS 78-30-8, no EINECS 201-103-5, nomenclature CAS : acide phosphorique, tris(2-méthylphényl)ester); il est également connu sous le nom de tris-o-crésylphosphate. 1.4. Principe de la méthode d'essai La substance à tester est administrée oralement, en une prise unique, à des poules domestiques qui ont été protégées, le cas échéant, contre des effets cholinergiques aigus. Les animaux sont observés pendant 21 jours pour détecter des troubles du comportement, une ataxie et une paralysie. Des analyses biochimiques sont réalisées, en particulier pour mettre en évidence l'inhibition de l'estérase NTE, sur des poules sélectionnées au hasard dans chaque lot, en général 24 et 48 heures après administration. 21 jours après l'exposition, les poules restantes sont sacrifiées et un examen histopathologique est effectué sur des tissus nerveux choisis. 1.5. Description de la méthode d'essai 1.5.1. Préparation De jeunes poules adultes exemptes d'affections virales, ne faisant l'objet d'aucune médication susceptible d'interférer et ne présentant pas de troubles de la démarche sont réparties au hasard en lots d'expérience et lots témoins, et sont acclimatées aux conditions du laboratoire pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude.
Les cages ou enclos utilisés doivent être suffisamment grands pour que les poules puissent se mouvoir librement et pour que leur démarche puisse être aisément observée.
La substance à tester est généralement administrée oralement, par gavage ou dans des capsules de gélatine, ou par une méthode comparable. Les substances liquides peuvent être administrées directement ou dissoutes dans un véhicule approprié tel que l'huile de maïs; les substances solides doivent si possible être dissoutes car il se peut que d'importantes quantités de solides administrées dans des capsules de gélatine ne soient pas bien absorbées. Si le véhicule est autre que de l'eau, ses caractéristiques toxiques doivent être connues et, dans le cas contraire, déterminées avant le début de l'essai. 1.5.2. Conditions de l'essai 1.5.2.1. Animaux d'expérience L'espèce recommandée est la poule pondeuse domestique adulte jeune agée de 8-12 mois (Gallus gallus domesticus). Il convient d'utiliser des races et souches de taille standard; les poules doivent normalement avoir été élevées dans des conditions leur permettant de se mouvoir librement. 1.5.2.2. Nombre et sexe Outre le lot d'expérience, il faut prévoir un lot témoin recevant le véhicule seul et un lot témoin positif. Le lot recevant le véhicule seul doit être traité de la même façon que le lot d'expérience, exception faite de l'administration de la substance à tester.
Il faut prévoir suffisamment d'animaux dans chaque lot pour que l'on puisse en sacrifier au moins six pour effectuer les déterminations biochimiques (trois à chacun des deux temps de prélèvement) et qu'il en survive six après la période d'observation de 21 jours.
Le lot témoin positif peut être réalisé en parallèle ou provenir d'expériences antérieures récentes. Il doit se composer d'au moins six poules traitées par un produit neurotoxique connu à effet retardé; trois poules seront réservées aux examens biochimiques et trois à la recherche de signes pathologiques. La mise à jour périodique des données historiques recueillies antérieurement est recommandée. De nouveaux lots positifs devront être réalisés si une des conditions essentielles de l'expérience (par exemple souches, alimentation, hébergement) a été modifiée par le laboratoire chargé de l'essai. 1.5.2.3. Niveau de doses Il convient d'effectuer une étude préliminaire sur un nombre approprié de poules réparties dans des lots traités à différentes doses, afin de déterminer la dose à utiliser pour l'étude principale. Un certain taux de mortalité est inévitable dans cette étude préliminaire. Toutefois, pour éviter la mort consécutive à des effets cholinergiques aigus, il est possible d'utiliser de l'atropine ou un autre agent protecteur ne perturbant pas la réaction neurotoxique différée. Diverses méthodes d'essai peuvent être utilisées pour évaluer la dose non létale maximale d'une substance (voir méthode B.1bis). Les données recueillies antérieurement sur les poules ou d'autres informations toxicologiques peuvent également être utiles pour déterminer la dose.
La dose utilisée dans l'étude principale doit être aussi élevée que possible, compte tenu des résultats de l'étude préliminaire et de la limite supérieure de 2 000 mg/kg poids corporel. Quel que soit le taux de mortalité, il doit subsister un nombre suffisant d'animaux pour effectuer les analyses biochimiques (six) et l'examen histologique (six) au 21ème jour. Il convient d'utiliser de l'atropine ou un autre agent qui ne perturbe pas les réactions neurotoxiques différées, afin d'éviter la mort par effets cholinergiques aigus. 1.5.2.4. Essai limite Lorsqu'un essai réalisé selon le mode opératoire décrit ci-après, à une dose d'au moins 2 000 mg/kg p.c./jour, n'entraîne pas d'effets toxiques observables et que les données relatives aux substances de structure voisine ne laissent pas supposer une toxicité, il n'est pas nécessaire d'effectuer une étude à une dose plus élevée. L'essai limite est applicable, sauf lorsqu'une exposition humaine fait apparaître la nécessité d'utiliser une dose plus élevée. 1.5.2.5. Période d'observation La période d'observation doit s'étendre sur 21 jours. 1.5.3. Mode opératoire Après administration d'un agent protecteur pour éviter que des effets cholinergiques aigus n'entraînent la mort, la substance à tester est administrée en une prise unique. 1.5.3.1. Observation générale L'observation doit débuter immédiatement après l'exposition. Toutes les poules sont observées soigneusement plusieurs fois au cours des deux premiers jours, puis au moins une fois par jour, pendant 21 jours ou jusqu'à la date prévue du sacrifice. Tous les signes de toxicité doivent être notés, ainsi que la date d'apparition des troubles du comportement, leur type, leur gravité et leur durée. L'ataxie doit être mesurée à l'aide d'une échelle d'évaluation ordinale comportant au moins quatre niveaux; la paralysie doit être notée. Au moins deux fois par semaine, les poules destinées à la recherche des signes pathologiques doivent être sorties de leurs cages et soumises à une épreuve d'activité motrice forcée, d'escalade d'échelles par exemple, afin de faciliter l'observation de faibles manifestations de toxicité.
Les animaux moribonds ou présentant des signes de détresse ou de souffrance intense doivent être immédiatement retirés de l'étude, euthanasiés et autopsiés. 1.5.3.2. Poids corporel Toutes les poules sont pesées juste avant l'administration de la substance, et au moins une fois par semaine par la suite. 1.5.3.3. Biochimie Six poules choisies au hasard dans chacun des lots d'expérience et des lots témoins négatifs, ainsi que trois poules prélevées dans le lot témoin positif (si l'essai est réalisé en parallèle sur ce dernier) sont sacrifiées quelques jours après administration; le cerveau et la moelle épinière lombaire sont préparés et analysés pour détecter l'inhibition de l'estérase caractéristique des neuropathies. Il peut en outre s'avérer utile d'analyser l'inhibition de cette estérase sur du nerf sciatique. En règle générale, trois poules du lot témoin et de chaque lot d'expérience sont sacrifiées après 24 heures et trois autres après 48 heures, tandis que les trois poules du lot témoin positif sont sacrifiées après 24 heures. Si l'observation des signes cliniques d'intoxication (souvent estimés par le moment d'apparition des effets cholinergiques) indique que la substance toxique est éliminée très lentement, il peut s'avérer préférable de prélever les tissus sur trois poules à deux autres temps compris entre 24 heures et au plus tard 72 heures après administration.
S'il y a lieu, il est également possible d'effectuer des déterminations de l'acétylcholinestérase (AChE) sur des échantillons.
Toutefois, il peut y avoir réactivation spontanée de l'acétylcholinestérase in vivo, ce qui pourrait faire sous-estimer l'activité de la substance en tant qu'inhibiteur de l'AChE. 1.5.3.4. Autopsie L'autopsie de tous les animaux (sacrifices prévus ou exigés par l'état de l'animal) doit comporter un examen de l'aspect du cerveau et de la moelle épinière. 1.5.3.5. Examen histopathologique Les tissus nerveux des animaux survivants après la période d'observation et non utilisés pour les études biochimiques doivent faire l'objet d'un examen microscopique. Les tissus doivent être fixés in situ par des techniques de perfusion. Les coupes doivent être pratiquées au niveau du cervelet (plan longitudinal moyen), du bulbe rachidien, de la moelle épinière et des nerfs périphériques. Les coupes de la moelle épinière seront pratiquées dans la partie cervicale supérieure, dans la région thoracique moyenne et dans la région lombo-sacrée. Des coupes devront également être réalisées dans la partie distale du nerf tibial et au niveau de ses ramifications vers les muscles gastrocnémiens, ainsi qu'au niveau du nerf sciatique.
Les coupes seront colorées à l'aide de colorants appropriés, spécifiques de la myéline et des axones. 2. RESULTATS En règle générale, si les résultats obtenus pour les différents points d'évaluation retenus (biochimie, histopathologie et observation du comportement) sont négatifs, il n'est normalement pas nécessaire de poursuivre les essais de neurotoxicité différée.Les résultats équivoques ou non concluants peuvent nécessiter une poursuite de l'étude.
Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuellement. En outre, tous les résultats doivent être présentés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux présents au début de l'essai, le nombre d'animaux présentant des lésions, des troubles du comportement ou des modifications biochimiques, le type et la gravité de ces lésions ou troubles, ainsi que le pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion ou trouble aux différents niveaux de gravité.
Les résultats de cette étude doivent être évalués du point de vue de l'incidence, de la gravité et de la corrélation entre les effets comportementaux, biochimiques et histopathologiques et tout autre effet observé dans les lots traités et les lots témoins.
Les résultats numériques seront évalués par des méthodes statistiques appropriées et reconnues. Ces méthodes statistiques doivent être choisies lors de la conception de l'étude. 3. COMPTE RENDU Procès-verbal d'essai Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants : Animaux d'expérience : - souche utilisée, - nombre d'animaux et âge, - origine, conditions d'hébergement, etc., - poids de chaque animal au début de l'expérience.
Conditions expérimentales : - détails concernant la préparation de la substance à tester, sa stabilité et son homogénéité, s'il y a lieu, - justification du choix du véhicule, - détails concernant l'administration de la substance à tester, - détails concernant la qualité de la nourriture et de l'eau, - justification du choix de la dose, - spécification des doses administrées, avec indications détaillées concernant le véhicule, le volume et la forme physique de la substance administrée, - identité de l'agent protecteur éventuel et détails concernant son administration.
Résultats : - données relatives au poids corporel, - données concernant la réaction toxique par groupe, y compris la mortalité, - nature, gravité et durée des effets cliniques observés (réversibilité éventuelle), - description détaillée des méthodes biochimiques et de leurs résultats, - résultats de l'autopsie, - description détaillée de tous les résultats histopathologiques, - le cas échéant, traitement statistique des résultats.
Discussion des résultats Conclusion 4. REFERENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 418 de l'OCDE. B.38 NEUROTOXICITE RETARDEE DES SUBSTANCES ORGANOPHOSPHOREES ETUDE PAR ADMINISTRATION REITEREE SUR 28 JOURS 1. METHODE 1.1. Introduction Lorsqu'on évalue les effets toxiques des substances, il est important d'étudier la capacité qu'ont certaines substances à entraîner certains types de neurotoxicité que les autres études de toxicité pourraient ne pas mettre en évidence. Certains composés organophosphorés ont une neurotoxicité différée et doivent faire l'objet de telles études.
Des essais de dépistage in vitro peuvent être utilisés pour identifier les substances susceptibles d'entraîner une polyneuropathie différée; toutefois, des résultats négatifs à l'issue d'études in vitro ne suffisent pas à prouver que la substance testée n'est pas neurotoxique.
Cet essai de neurotoxicité retardée sur 28 jours fournit des informations sur d'éventuels dangers pour la santé pouvant découler d'expositions répétées au cours d'une période déterminée. Il donnera des informations sur la relation dose-effet et pourra fournir une estimation du niveau de dose sans effet néfaste observé, pouvant être utile à l'établissement des critères de sécurité pour l'exposition.
Voir introduction générale, partie B. 1.2. Définitions Les substances organophosphorées comprennent les esters, thioesters organophosphorés non chargés ou anhydrides des acides organophosphoriques, organophosphoniques ou organophosphoramidiques ou des acides phosphorothioïques, phosphonothioïques ou phosphorothioamidiques apparentés ou d'autres substances pouvant entraîner la neurotoxicité différée parfois observée pour les substances de cette classe.
La neurotoxicité retardée est un syndrome associé à l'installation prolongée et d'ataxie retardée, associée à des axonopathies distales au niveau de la moelle épinière et des nerfs périphériques, et à une inhibition et un vieillissement de l'estérase caractéristique des neuropathies (neuropathy target esterase - NTE) dans les tissus nerveux. 1.3. Principe de la méthode d'essai La substance à tester est administrée quotidiennement par voie orale à des poules domestiques pendant 28 jours. Les animaux sont observés au moins une fois par jour pour rechercher des troubles du comportement, une ataxie et une paralysie, et ce jusqu'au 14ème jour après administration de la dernière dose. Des analyses biochimiques sont réalisées, en particulier pour mettre en évidence l'inhibition de l'estérase NTE, sur des poules sélectionnées au hasard dans chaque lot, en général 24 et 48 heures après la dernière administration. Deux semaines après la dernière administration, les poules restantes sont sacrifiées et un examen histopathologique est effectué sur certains tissus nerveux. 1.4. Description de la méthode d'essai 1.4.1. Préparation De jeunes poules adultes exemptes d'affections virales, ne faisant l'objet d'aucune médication susceptible d'interférer et ne présentant pas de troubles de la démarche sont réparties au hasard entre les lots d'expérience et les lots témoins, et sont acclimatées aux conditions du laboratoire pendant au moins 5 jours avant le début de l'étude.
Les cages ou enclos utilisés doivent être suffisamment grands pour que les poules puissent se déplacer librement et pour que leur démarche puisse être aisément observée.
La substance à tester doit être administrée par voie orale chaque jour, sept jours sur sept, de préférence par gavage ou dans des capsules de gélatine. Les substances liquides peuvent être administrées directement ou dissoutes dans un véhicule approprié tel que l'huile de maïs; les substances solides doivent si possible être dissoutes car il se peut que d'importantes quantités de solides administrées dans des capsules de gélatine ne soient pas bien absorbées. Si le véhicule est autre que de l'eau, ses caractéristiques toxiques doivent être connues et, dans le cas contraire, déterminées avant le début de l'essai. 1.4.2. Conditions de l'essai 1.4.2.1. Animaux d'expérience Il est recommandé d'utiliser de jeunes poules pondeuses adultes (Gallus gallus domesticus) âgées de 8 à 12 mois. Il convient d'utiliser des races et souches de taille standard; les poules doivent normalement avoir été élevées dans des conditions leur permettant de se déplacer librement. 1.4.2.2. Nombre et sexe En règle générale, il faut prévoir au moins trois lots d'expérience et un lot témoin recevant uniquement le véhicule. Le lot recevant le véhicule seul doit être traité de la même façon que le lot d'expérience, exception faite de l'administration de la substance à tester.
Il faut prévoir suffisamment d'animaux dans chaque lot pour que l'on puisse en sacrifier au moins six pour effectuer les analyses biochimiques (trois lors de chacun des deux temps de prélèvement) et qu'il en survive six après la période d'observation post-traitement de 14 jours. 1.4.2.3. Doses Les doses doivent être sélectionnées en tenant compte des résultats d'un essai de neurotoxicité retardée après exposition aiguë et de toute autre information disponible concernant la toxicité ou la cinétique de la substance à tester. La dose la plus élevée doit être choisie dans le but de produire des effets toxiques et de préférence une neurotoxicité différée, sans entraîner la mort ni des souffrances manifestes. Il convient ensuite de définir une série décroissante de doses afin de mettre en évidence une éventuelle relation dose-effet et une dose minimale n'entraînant aucun effet observable. 1.4.2.4. Essai limite Lorsqu'un essai réalisé selon le mode opératoire décrit ci-après, à une dose d'au moins 1 000 mg/kg p.c./jour, n'entraîne pas d'effets toxiques observables et que les données relatives aux substances de structure apparentée ne laissent pas supposer une toxicité, il n'est pas nécessaire d'effectuer une étude à une dose plus élevée. L'essai limite est applicable, sauf lorsqu'une exposition humaine fait apparaître la nécessité d'utiliser une dose plus élevée. 1.4.2.5. Période d'observation Tous les animaux doivent être observés au moins une fois par jour pendant la période d'exposition et pendant les 14 jours suivants, sauf si une autopsie est prévue. 1.4.3. Mode opératoire La substance à tester est administrée tous les jours, sept jours sur sept, pendant 28 jours. 1.4.3.1. Observation générale L'observation doit débuter immédiatement après l'exposition. Toutes les poules sont observées attentivement au moins une fois par jour pendant les 28 jours de traitement et pendant les 14 jours suivants ou jusqu'à la date prévue de leur sacrifice. Tous les signes de toxicité doivent être consignés, ainsi que leur date d'apparition, leur type, leur gravité et leur durée. L'observation doit porter sur les troubles du comportement, sans toutefois s'y limiter. L'ataxie doit être mesurée à l'aide d'une échelle d'évaluation ordinale comportant au moins quatre niveaux; la paralysie doit être consignée. Au moins deux fois par semaine, les poules doivent être sorties de leurs cages et soumises à une épreuve d'activité motrice forcée, d'escalade d'échelles, par exemple, afin de faciliter l'observation des effets toxiques minimaux. Les animaux moribonds ou présentant des signes de détresse ou de souffrance intense doivent être immédiatement retirés de l'étude, euthanasiés et autopsiés. 1.4.3.2. Poids corporel Toutes les poules sont pesées juste avant la première administration de la substance, et au moins une fois par semaine par la suite. 1.4.3.3. Biochimie Six poules prélevées au hasard dans chacun des lots d'expérience et des lots témoins recevant le véhicule seul sont sacrifiées quelques jours après la dernière administration; le cerveau et la moelle épinière lombaire sont préparés et analysés pour détecter l'inhibition de l'estérase caractéristique des neuropathies (NTE). Il peut en outre s'avérer utile de rechercher l'inhibition de cette estérase sur le nerf sciatique. En règle générale, trois poules du lot témoin et de chaque lot d'expérience sont sacrifiées 24 heures après la dernière administration et trois autres 24 heures plus tard, soit 48 heures après la dernière administration; si les résultats de l'étude par exposition aiguë ou d'autres études (étude toxicocinétique, par exemple) indiquent qu'il est préférable de choisir d'autres temps de sacrifices, les temps de sacrifices seront modifiés en conséquence et les documents justificatifs seront fournis.
S'il y a lieu, il est également possible d'effectuer des déterminations de l'acétylcholinestérase (AChE) sur ces échantillons.
Toutefois, il peut y avoir réactivation spontanée de l'acétylcholinestérase in vivo, ce qui pourrait faire sous-estimer l'activité de la substance en tant qu'inhibiteur de l'AChE. 1.4.3.4. Autopsie L'autopsie de tous les animaux (sacrifice programmé ou imposé par l'état des animaux) doit comporter un examen de l'aspect du cerveau et de la moelle épinière. 1.4.3.5. Examen histopathologique Les tissus nerveux des animaux survivants après la période d'observation et non utilisés pour les études biochimiques doivent faire l'objet d'un examen microscopique. Les tissus doivent être fixés in situ par des techniques de perfusion. Les coupes doivent être pratiquées au niveau du cervelet (plan longitudinal moyen), du bulbe rachidien, de la moelle épinière et des nerfs périphériques. Les coupes de la moelle épinière seront pratiquées dans la partie cervicale supérieure, dans la région thoracique moyenne et dans la région sacro-lombaire. Des coupes devront également être réalisées dans la région distale du nerf tibial et au niveau de ses ramifications vers les muscles jumeaux du triceps, ainsi qu'au niveau du nerf sciatique. Les coupes seront colorées à l'aide de colorants appropriés, spécifiques de la myéline et des axones. Dans un premier temps, l'examen microscopique sera effectué sur les tissus conservés de tous les animaux du lot traité à la dose la plus élevée et du lot témoin. Si des effets sont mis en évidence dans le lot traité à la dose la plus élevée, l'examen microscopique devra également porter sur les tissus des animaux des lots traités à la dose intermédiaire et à la dose faible. 2. RESULTATS En règle générale, si les résultats obtenus pour les différents critères d'évaluation retenus dans cette méthode (biochimie, histopathologie et observation du comportement) sont négatifs, il n'est pas nécessaire de poursuivre les essais de neurotoxicité différée.Les résultats équivoques ou non concluants peuvent nécessiter une poursuite de l'étude.
Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuellement. En outre, tous les résultats doivent être récapitulés dans un tableau indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux présents au début de l'essai, le nombre d'animaux présentant des lésions, des troubles du comportement ou des modifications biochimiques, le type et la gravité de ces lésions ou symptômes, ainsi que le pourcentage d'animaux présentant chaque type de lésion ou symptôme aux différents niveaux de gravité.
Les résultats de cette étude doivent être évalués du point de vue de l'incidence, de la gravité et de la corrélation entre les effets comportementaux, biochimiques et histopathologiques et tout autre effet observé dans les lots traités et les lots témoins.
Les résultats numériques seront évalués par des méthodes appropriées et reconnues. Ces méthodes statistiques doivent être choisies lors de la conception de l'étude. 3. COMPTE RENDU Procès-verbal d'essai Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants : Animaux d'expérience : - souche utilisée, - nombre d'animaux et âge, - origine, conditions d'hébergement, etc., - poids de chaque animal au début de l'expérience.
Conditions expérimentales : - détails concernant la préparation de la substance à tester, sa stabilité et son homogénéité, s'il y a lieu, - justification du choix du véhicule, - détails concernant l'administration de la substance à tester, - détails concernant la qualité de la nourriture et de l'eau, - justification du choix de la dose, - spécification des doses administrées, avec indications détaillées concernant le véhicule, le volume et la forme physique de la substance administrée, - si les déterminations biochimiques ne sont pas pratiquées 24 et 48 heures après la dernière administration, justification du choix d'autres temps.
Résultats : - données relatives au poids corporel, - données concernant la réaction toxique par groupe, y compris la mortalité, - niveau de dose sans effet néfaste observé, - nature, gravité et durée des effets cliniques observés (réversibilité éventuelle), - description détaillée des méthodes biochimiques et de leurs résultats, - résultats de l'autopsie, - description détaillée de tous les résultats histopathologiques, - le cas échéant, traitement statistique des résultats.
Discussion des résultats Conclusion 4. REFERENCES Cette méthode reprend la ligne directive 419 de l'OCDE.» Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS
Annexe III A. Les sections 8 et 9 du « sommaire » de l'annexe sont modifiées comme suit : « 8. CAS PARTICULIER : SUBSTANCES 8.1. Récipients de gaz transportables 8.2. Récipients de gaz destinés au propane, au butane ou au gaz de pétrole liquéfié (GPL) 8.3. Métaux sous forme massive 8.4. Substances classées avec la phrase R 65 9. CAS PARTICULIERS : PREPARATIONS 9.1. Préparations gazeuses (mélanges de gaz) 9.2. Récipients de gaz destinés à des préparations contenant du propane, du butane ou du gaz de pétrole liquéfié (GPL) nauséabonds 9.3. Alliages, préparations contenant des polymères et préparations contenant des élastomères 9.4. Préparations classées avec la phrase R 65 9.5. Peroxydes organiques » B. Le texte suivant est inclus dans la section 3.2.3 après les critères relatifs à la phrase R 20 : « Nocif par inhalation » : « R 65 Nocif : peut provoquer une atteinte des poumons en cas d'ingestion Les substances et préparations liquides présentant, pour l'homme, un danger en cas d'aspiration en raison de leur faible viscosité : a) pour les substances et préparations contenant des hydrocarbures aliphatiques, alicycliques et aromatiques dans une concentration totale supérieure ou égale à 10 % et possédant : - soit un temps d'écoulement inférieur à 30 s dans une coupe ISO de 3 mm, conformément à la norme EN 535 - soit une viscosité cinématique inférieure à 7 x 10-6 m2/s à 40 °C, mesurée par un viscosimètre capillaire calibré en verre conformément à la norme ISO 3104/3105 - soit une viscosité cinématique inférieure à 7 x 10-6 m2/s à 40 °C, déduite de mesures par viscosimètre rotatif conformément à la norme ISO 3219 Note : les substances et préparations répondant à ces critères ne nécessitent pas d'être classées si leur tension superficielle moyenne est supérieure à 25 mN/m à 40 °C.b) pour d'autres substances et préparations ne répondant pas aux critères ci-dessus, sur la base de l'expérience pratique chez l'homme. » C. Le texte de la section 3.2.6.3 est remplacé par le texte suivant : « 3.2.6.3. Irritation du système respiratoire La phrase de risque suivante sera attribuée conformément aux critères donnés ci-dessous : R 37 Irritant pour les voies respiratoires Substances et préparations qui causent une irritation grave du système respiratoire, sur la base : - d'observations chez l'homme - de résultats positifs obtenus au cours d'essais appropriés sur l'animal Commentaires sur l'emploi de la phrase R 37 Il convient, en interprétant les observations chez l'homme, de faire la distinction entre les effets entraînant une classification avec la phrase R 48 (cf. section 3.2.4) et les effets entraînant une classification avec la phrase R 37. Les conditions entraînant normalement la classification avec R 37 sont réversibles et généralement limitées aux voies respiratoires supérieures.
Des résultats positifs obtenus au cours d'essais appropriés chez l'animal peuvent inclure des données obtenues dans un essai de toxicité générale notamment des données histopathologiques concernant le système respiratoire. On peut également utiliser des données obtenues à partir de la mesure de la bradypnée expérimentale pour évaluer l'irritation des voies respiratoires. » D. Le texte de la section 3.2.7, « Sensibilisation », est remplacé par le texte suivant : « 3.2.7. Sensibilisation 3.2.7.1. Sensibilisation par inhalation Les substances et préparations seront classées sensibilisantes et caractérisées par le symbole « Xn » :, l'indication de danger « nocif » : et la phrase de risque R 42, conformément aux critères mentionnés ci-dessous : R 42 Peut entraîner une sensibilisation par inhalation - s'il est établi que la substance ou préparation concernée peut provoquer une hypersensibilité respiratoire spécifique chez l'homme - si des essais appropriés sur l'animal ont donné des résultats positifs - si la substance est un isocyanate, sauf s'il existe des preuves qu'elle ne provoque pas d'hypersensibilité respiratoire Commentaires concernant l'utilisation de la phrase R 42 Preuves des effets chez l'homme Les preuves que la substance peut provoquer une hypersensibilité respiratoire spécifique seront en principe fondées sur l'expérience chez l'homme. Dans ce cadre, l'asthme est considéré comme une expression de l'hypersensibilité, mais d'autres réactions d'hypersensibilité comme la rhinite et l'alvéolite sont aussi prises en considération. Les manifestations observées devront avoir le caractère clinique d'une réaction allergique. Cependant, il n'est pas nécessaire de démontrer le caractère immunologique des mécanismes.
Lorsque les preuves proviennent de données d'exposition humaine, il est nécessaire pour décider de la classification, de tenir compte, outre les preuves fournies par les cas étudiés, des éléments suivants : - importance de la population exposée - étendue de l'exposition Les preuves susmentionnées peuvent être : - des antécédents cliniques et des résultats de tests fonctionnels respiratoires appropriés reliés à l'exposition à la substance, confirmés par d'autres preuves, par exemple : - une structure chimique apparentée à des substances connues pour provoquer une hypersensibilité respiratoire; - un test immunologique in vivo (par exemple : prick test cutané); - un test immunologique in vitro (par exemple, analyse sérologique); - des études pouvant mettre en évidence d'autres mécanismes spécifiques mais non immunologiques, par exemple une irritation légère répétée, des effets liés à une action pharmacologique. - des résultats positifs obtenus lors de tests de provocation bronchique réalisés avec la substance et effectués selon des lignes directrices reconnues pour la détermination d'une réaction d'hypersensibilité spécifique.
Les antécédents cliniques doivent comprendre à la fois les antécédents médicaux et professionnels, afin de déterminer la relation entre l'exposition à une substance particulière et le développement d'une hypersensibilité respiratoire. Les informations à prendre en compte portent notamment sur les facteurs d'aggravation aussi bien au domicile que sur le lieu de travail, sur l'apparition et l'évolution de la maladie, sur les antécédents familiaux et médicaux du patient.
Les antécédents médicaux doivent également inclure la mention d'autres désordres allergiques ou respiratoires apparus depuis l'enfance, ainsi que les antécédents de tabagisme.
Les résultats positifs de tests de provocation bronchique sont considérés apporter par eux-mêmes des preuves suffisantes pour entraîner la classification. On reconnaît cependant que, dans la pratique, beaucoup des examens susmentionnés auront déjà été effectués.
Les substances qui provoquent des symptômes d'asthme par irritation uniquement chez les sujets présentant une hyperréactivité bronchique ne doivent pas être classées avec la phrase R 42.
Etudes sur l'animal Les données expérimentales susceptibles d'indiquer pour une substance un potentiel sensibilisant par inhalation chez l'homme peuvent comprendre : - des mesures des IgE (par exemple sur la souris) - des réactions pulmonaires spécifiques chez le cobaye 3.2.7.2. Sensibilisation par contact cutané Les substances et préparations seront classées sensibilisantes et caractérisées par le symbole « Xi », l'indication de danger « irritant » : et la phrase de risque R 43 conformément aux critères mentionnés ci-dessous : R 43 Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau - si l'expérience montre que la substance ou préparation peut provoquer une sensibilisation par contact avec la peau chez un nombre significatif de personnes - si des essais appropriés chez l'animal donnent des résultats positifs Commentaires concernant l'utilisation de la phrase R 43 Preuves d'effets chez l'homme Les preuves suivantes (expérience pratique) sont suffisantes pour classer une substance avec la phrase R 43 : - résultats positifs de tests épicutanés (patch tests) appropriés obtenus en principe dans plus d'une clinique dermatologique; ou, - études épidémiologiques montrant l'apparition de dermites de contact allergiques causées par la substance. Les circonstances dans lesquelles une forte proportion des personnes exposées manifeste des symptômes caractéristiques doivent être étudiées avec une attention particulière, même si les cas sont peu nombreux; ou, - données positives obtenues au cours d'études expérimentales chez l'homme (cf. également 3.1.1) Les éléments suivants sont suffisants pour classer une substance avec la phrase R 43 lorsqu'ils sont étayés par des preuves supplémentaires : - épisodes isolés de dermite de contact allergique, ou - études épidémiologiques pour lesquelles les éléments liés au hasard, les biais ou les facteurs de confusion n'ont pas été exclus avec un degré raisonnable de certitude.
Les preuves supplémentaires nécessaires pour étayer les éléments ci-dessus peuvent être notamment : - des données obtenues au cours d'essais sur l'animal réalisés selon des lignes directrices reconnues, donnant des résultats ne satisfaisant pas les critères énoncés dans la section relative aux études sur l'animal mais suffisamment proches des limites pour être considérés comme significatifs; - des données obtenues par des méthodes non normalisées, ou - des relations structure-activité appropriées.
Etudes chez l'animal Des résultats positifs d'essais appropriés chez l'animal sont : Dans le cas de la méthode d'essai de type adjuvant pour la sensibilisation de la peau décrite à l'annexe V, ou dans le cas d'autres méthodes d'essai de type adjuvant, une réponse d'au moins 30 % des animaux est considérée comme positive. Pour toute autre méthode d'essai, une réponse d'au moins 15 % des animaux est considérée comme positive. 3.2.7.3. Urticaire immunologique de contact Certaines substances répondant aux critères correspondant à la phrase R 42 peuvent en outre causer des urticaires immunologiques de contact.
Dans ce cas, il convient d'introduire l'information concernant les urticaires de contact à l'aide de phrases S appropriées (généralement les phrases S 24 et S 36/37), et de la mentionner dans la fiche de données de sécurité.
Pour les substances qui produisent des signes d'urticaire immunologique de contact mais qui ne répondent pas aux critères correspondant à la phrase R 42, il convient d'envisager une classification avec la phrase R 43.
Il n'existe pas de modèle animal reconnu pour identifier les substances causant des urticaires immunologiques de contact. La classification devra donc s'appuyer sur des preuves d'effets chez l'homme, similaires à celles concernant la sensibilisation cutanée (R 43). 3.2.7.4. Il faut remarquer que si le symbole « Xn » et l'indication de danger « nocif » sont attribués, le symbole « Xi » et l'indication de danger « irritant » sont facultatifs. » E. Le texte des critères correspondant à la phrase S 62 de la section 6 est remplacé par le texte suivant : « S 62 En cas d'ingestion, ne pas faire vomir; consulter immédiatement un médecin et lui montrer l'emballage ou l'étiquette. - Applicabilité : - Substances et préparations classées nocives avec la phrase R 65 conformément aux critères énoncés dans la section 3.2.3, - non applicable aux substances et préparations placées sur le marché sous forme d'aérosols ou dans des récipients munis d'un dispositif scellé de pulvérisation (cf. sections 8 et 9); - Critères d'utilisation : - Obligatoire pour les substances et préparations susmentionnées, si elles sont vendues au public ou susceptibles d'être utilisées par le public, - recommandé pour les substances et préparations susmentionnées utilisées dans l'industrie. » F. La section suivante est ajoutée à la section 8 : « 8.2. Récipients de gaz destinés au propane, au butane ou au gaz de pétrole liquéfié (GPL) Ces substances sont classées à l'annexe I. Bien que leur classification soit conforme à l'article 1er, § 4, elles ne présentent pas de danger pour la santé humaine lorsqu'elles sont placées sur le marché, comme gaz combustibles libérés uniquement en vue de leur combustion, dans des bouteilles fermées réemplissables ou dans des cartouches non rechargeables couvertes par la norme EN 417.
Ces bouteilles et ces cartouches doivent être étiquetées avec le symbole approprié et les phrases R et S concernant l'inflammabilité.
Il n'est pas requis d'indiquer sur l'étiquette les informations concernant les effets sur la santé humaine. Cependant ces informations qui auraient dû apparaître sur l'étiquette seront transmises à l'utilisateur professionnel par la personne responsable de la mise sur le marché de la substance, sous la forme prévue à l'article 9, § 2 du présent arrêté. En ce qui concerne les consommateurs, il leur sera transmis suffisamment d'informations pour leur permettre de prendre toutes les mesures nécessaires pour la santé et la sécurité, comme il est prévu à l'article 12 paragraphe 3 de l'A.R. du 11 janvier 1993.
G. Le titre de la section « 8.2 Métaux sous forme massive » est remplacé par : « 8.3. Métaux sous forme massive » H. La section suivante est ajoutée à la section 8 : « 8.4. Substances classées avec la phrase R 65 Pour les substances classées nocives en raison du danger en cas d'aspiration, il n'est pas nécessaire de les étiqueter « nocif » : avec la phrase R 65 si elles sont placées sur le marché sous forme d'aérosols ou dans des récipients munis d'un dispositif scellé de pulvérisation. » I. Le texte de la section 9.1.3 est remplacé par le texte suivant : « 9.1.3. Etiquetage Pour les récipients de gaz transportables, on considère que les prescriptions relatives à l'étiquetage sont conformes lorsqu'elles sont conformes aux dispositions de l'article 10 paragraphe 5 de l'A.R. du 11 janvier 1993.
Toutefois, par dérogation à l'article 10 paragraphes 1 et 2, pour les récipients de gaz ayant une capacité en eau inférieure ou égale à 150 litres, le format et les dimensions de l'étiquette peuvent respecter les prescriptions de la norme ISO 7225. Dans ce cas, l'étiquette peut mentionner le nom générique ou l'appellation industrielle ou commerciale de la préparation à condition que le nom des substances dangereuses entrant dans sa composition figurent de manière claire et indélébile sur le corps du récipient de gaz.
Les informations mentionnées à l'article 9 peuvent être fournies sur un disque ou une étiquette durable, solidement fixé au récipient. » J. La section suivante est ajoutée à la section 9 : « 9.2. Récipients de gaz destinés à des préparations contenant du propane, du butane ou du gaz de pétrole liquefié (GPL) nauséabonds Le propane, le butane et le gaz de pétrole liquéfié sont classés à l'annexe I. Bien que les préparations contenant ces substances soient classées conformément à l'article 5 de l'A.R. du 11 janvier 1993, elles ne présentent pas de danger pour la santé humaine lorsqu'elles sont placées sur le marché, comme gaz combustibles libérés uniquement en vue de leur combustion, dans des bouteilles fermées réemplissables ou dans des cartouches non rechargeables couvertes par la norme EN 417.
Ces bouteilles et ces cartouches doivent être étiquetées avec le symbole approprié et les phrases R et S concernant l'inflammabilité.
Il n'est pas requis d'indiquer sur l'étiquette les informations concernant les effets sur la santé humaine. Cependant, ces informations qui auraient dû apparaître sur l'étiquette seront transmises à l'utilisateur professionnel par la personne responsable de la mise sur le marché de la préparation sous la forme prévue à l'article 12 de l'A.R. du 11 janvier 1993 En ce qui concerne les consommateurs, il leur sera transmis suffisamment d'informations pour leur permettre de prendre toutes les mesures nécessaires pour la santé et la sécurité, comme il est prévu à l'article 12 paragraphe 3 de l'A.R. du 11 janvier 1993. » K. Le titre de la section « 9.2 Alliages, préparations contenant des polymères et préparations contenant des élastomères » est remplacé par : « 9.3. Alliages, préparations contenant des polymères et préparations contenant des élastomères » L. La section suivante est ajoutée à la section 9 : « 9.4. Préparations classées avec la phrase R 65 Pour les préparations classées nocives en raison du danger en cas d'aspiration, il n'est pas nécessaire de les étiqueter « nocif » : avec la phrase R 65 si elles sont placées sur le marché sous forme d'aérosols ou dans des récipients munis d'un dispositif scellé de pulvérisation. » M. Le titre de la section « 9.4 Peroxydes organiques », est remplacé par : « 9.5. Peroxydes organiques » Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998.
ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS