16 APRIL 1998. - Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 26 november 1981 betreffende referentieanalysemethoden die moeten worden toegepast om de samenstelling van cosmetica te controleren

ALBERT II, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet.

Gelet op de wet van 24 januari 1977 betreffende de bescherming van de gezondheid van de verbruikers op het stuk van de voedingsmiddelen en andere producten, inzonderheid op artikel 12, gewijzigd door de wet van 22 maart 1989;

Gelet op het koninklijk besluit van 26 november 1981 betreffende referentieanalysemethoden die moeten worden toegepast om de samenstelling van cosmetica te controleren, gewijzigd door de koninklijke besluiten van 19 februari 1985, 5 november 1985, 30 juni 1986, 11 september 1987, 5 december 1990, 16 september 1991 en 1 april 1996;

Gelet op de zesde richtlijn 95/32/EG van de Commissie van 7 juli 1995 en de zevende richtlijn 96/45/EG van de Commissie van 2 juli 1996 inzake analysemethoden die moeten worden toegepast om de samenstelling van cosmetische producten te controleren;

Gelet op de wetten op de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973, inzonderheid op artikel 3, § 1, gewijzigd door de wetten van 9 augustus 1980, 16 juni 1989 en 4 juli 1989;

Gelet op de dringende noodzakelijkheid, verantwoord door de ingebrekestelling van de Commissie van 29 december 1997;

Op de voordracht van Onze Minister van Volksgezondheid en Pensioenen, Hebben Wij besloten en besluiten Wij :

Artikel 1.De analysemethoden, opgenomen in de bijlage van het koninklijk besluit van 26 november 1981 betreffende referentieanalysemethoden die moeten worden toegepast om de samenstelling van cosmetica te controleren, worden met de bepalingen XXXV tot XXXVII, opgenomen in bijlage van dit besluit, aangevuld.

Art. 2.Onze Minister van Volksgezondheid en Pensioenen is belast met de uitvoering van dit besluit.

Gegeven te Châteauneuf-de-Grasse, 16 april 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid en Pensioenen, M. COLLA

Bijlage XXXV. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur, salicylzuur en propionzuur in cosmetica 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de kwalitatieve en de kwantitatieve analyse van benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur, salicylzuur en propionzuur in cosmetica.Er worden afzonderlijke methoden beschreven voor de kwalitatieve analyse van deze conserveermiddelen, voor de kwantitatieve analyse van propionzuur en voor die van 4-hydroxybenzoëzuur, salicylzuur, sorbinezuur en benzoëzuur. 2. Definitie De volgens deze methode bepaalde gehaltes aan benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, salicylzuur, sorbinezuur en propionzuur worden uitgedrukt als massapercentage van de vrije zuren in het product. A. Kwalitatieve analyse 1. Beginsel Na zuur/base-extractie van de conserveermiddelen wordt het extract geanalyseerd met behulp van dunne-laagchromatografie (DLC) met derivatisering op de plaat.Afhankelijk van de resultaten wordt de identificatie bevestigd met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie of, in het geval van propionzuur, gaschromatografie. 2. Reagentia 2.1. Algemeen Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van minstens vergelijkbare zuiverheid te zijn. 2.2. Aceton. 2.3. Diëthylether. 2.4. Acetonitril. 2.5. Tolueen. 2.6. n-Hexaan. 2.7. Paraffine, vloeibaar. 2.8. Zoutzuur, 4 M. 2.9. Kaliumhydroxide, 4 M in water. 2.10. Calciumchloride, CaCl2.2H2O. 2.11. Lithiumcarbonaat, Li2CO3. 2.12. 2-Broom-2'-acetonafton. 2.13. 4-Hydroxybenzoëzuur. 2.14. Salicylzuur. 2.15. Benzoëzuur. 2.16. Sorbinezuur. 2.17. Propionzuur. 2.18. Referentieoplossingen Bereid oplossingen van 0,1 % (m/v) (100 mg/100 ml) van elk van de vijf conserveermiddelen (2.13 t/m 2.17) in diëthylether (2.3). 2.19. Derivatiseringsreagens Een oplossing van 0,5 % (m/v) 2-broom-2'-acetonafton (2.12) in acetonitril (2.4) (50 mg/10 ml). Deze oplossing moet wekelijks vers worden bereid en in de koelkast worden bewaard. 2.20. Katalysatoroplossing Een oplossing van 0,3 % (m/v) lithiumcarbonaat (2.11) in water (300 mg/100 ml). Deze oplossing moet vers worden bereid. 2.21. Loopvloeistof Tolueen (2.5)/aceton (2.2) (20:0,05; v/v). 2.22. Vloeibare paraffine (2.7)/n-hexaan (2.6) (1:2, v/v). 3. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting. 3.1. Waterbad, in staat de temperatuur op 60 °C te houden. 3.2. Ontwikkeltank. 3.3. UV-stralingsbron, 254 en 366 nm. 3.4. Dunne-laagplaten, kieselgel 60, zonder fluorescentie-indicator, 20 x 20 cm, laagdikte 0,25 mm met een concentreringszone van 2,5 x 20 cm (Merck 11845, of gelijkwaardig). 3.5. Injectiespuit, 10 |gml. 3.6. Injectiespuit, 25 |gml. 3.7. Oven, geschikt voor temperaturen tot 105 °C. 3.8. Glazen buizen met schroefdop, 50 ml. 3.9. Filtreerpapier, diameter 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband no. 5892, of gelijkwaardig. 3.10. Universeel pH-indicatorpapier, pH 1-11. 3.11. Glazen monsterflesjes (vials), 5 ml. 3.12. Rotatieverdamper (Rotavapor of gelijkwaardig). 3.13. Verwarmingsplaat. 4. Werkwijze 4.1. Monstervoorbereiding Weeg in een 50 ml glazen buis met schroefdop (3.8) circa 1 g monster af. Voeg vier druppels zoutzuur 4 M (2.8) en 40 ml aceton (2.2) toe.

Bij sterk alkalische produkten, zoals toiletzeep, moeten 20 druppels zoutzuur 4 M worden toegevoegd. Controleer met indicatorpapier (3.10) dat de pH ongeveer 2 is. Sluit de buis en schud krachtig gedurende 1 minuut.

Om de extractie van de conserveermiddelen in de acetonfase te bevorderen, kan het mengsel zonodig voorzichtig tot circa 60 °C verwarmd worden, zodat de vetfase smelt. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en filtreer over een papieren filter (3.9) in een erlenmeyer.

Breng 20 ml van het filtraat over in een erlenmeyer van 200 ml, voeg 20 ml water toe en meng. Breng de pH van het mengsel met kaliumhydroxide 4 M (2.9) op ongeveer 10; gebruik indicator-papier (3.10) om de pH te bepalen.

Voeg 1 g calciumchloride (2.10) toe en schud krachtig. Filtreer over een papieren filter (3.9) in een scheitrechter van 250 ml die 75 ml diëthylether (2.3) bevat en schud krachtig gedurende 1 minuut. Wacht tot de fasen gescheiden zijn en verzamel de waterlaag in een erlenmeyer van 250 ml. Verwerp de etherlaag. Breng op geleide van indicatorpapier de pH van de waterige oplossing door toevoeging van zoutzuur 4 M op ongeveer 2. Voeg 10 ml diëthylether toe, sluit de kolf en schud krachtig gedurende 1 minuut. Wacht tot de fasen gescheiden zijn en breng de etherlaag over in een rotatieverdamper (3.12).

Verwerp de waterlaag.

Damp de etherfractie in tot deze bijna droog is en los het residu op in 1 ml diëthylether (2.3). Breng de aldus verkregen oplossing over in een monsterflesje (3.11). 4.2. Dunne-laagchromatografie Breng voor elk van de te chromatografieren referentieoplossingen en monsteroplossingen op de startlijn in de concentreringszone van een DLC-plaat (3.4) met een injectiespuit (3.5) op gelijke afstanden circa 3 |gml lithiumcarbonaatoplossing (2.20) op en droog de plaat in een koude luchtstroom.

Leg de DLC-plaat op een op 40 °C gebrachte verwarmingsplaat (3.13) teneinde de vlekken zo klein mogelijk te houden. Breng met een injectiespuit 10 |gml van elk van de referentieoplossingen (2.18) en van de monsteroplossingen (4.1) op de startlijn van de plaat op, exact op de plaatsen waar tevoren de lithiumcarbonaatoplossing is opgebracht.

Breng tenslotte op exact dezelfde plaatsen, waar de referentieoplossingen, respectievelijk de monsteroplossingen en de lithiumcarbonaatoplossing zijn opgebracht, circa 15 |gml derivatiseringsreagens (2.19) (oplossing van 2-broom-2'-acetonafton) op.

Verwarm de DLC-plaat gedurende 45 minuten in een oven (3.7) op 80 °C. Laat de plaat afkoelen en plaats hem in een ontwikkeltank (3.2) met loopvloeistof (2.21) (tolueen/aceton), die gedurende 15 minuten geconditioneerd is (zonder filtreerpapierbekleding). Ontwikkel de plaat tot het vloeistoffront een afstand van 15 cm heeft afgelegd (dit duurt circa 80 minuten).

Droog de plaat in een koude luchtstroom en bekijk de verkregen vlekken onder UV-licht (3.3). Om de fluorescentie van de zwakke vlekken te verbeteren kan de DLC-plaat in vloeibare paraffine/n-hexaan (2.22) worden gedompeld. 5. Identificatie Bereken de Rf-waarde van de verkregen vlekken. Vergelijk de Rf-waarde en het gedrag onder UV-bestraling van het monster met de resultaten van de referentieoplossingen.

Trek een voorlopige conclusie omtrent de identiteit van de aanwezige conserveermiddelen. Verricht de in deel B beschreven HPLC-analyse of, indien propionzuur aanwezig lijkt, de in deel C beschreven GC-analyse.

Vergelijk de voor het monster verkregen retentietijden met die van de referentieoplossingen.

Bepaal aan de hand van de gecombineerde resultaten van DLC en HPLC of GC welke conserveermiddelen in het monster aanwezig waren.

B. Kwantitatieve analyse van benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur en salicylzuur 1. Beginsel Het monster wordt na aanzuren geëxtraheerd met een mengsel van ethanol en water.Na filtratie worden de conserveermiddelen kwantitatief bepaald met behulp van hogedruk-vloeistof-chromatografie (HPLC). 2. Reagentia 2.1. Alle reagentia moeten van analysekwaliteit en waar van toepassing geschikt voor HPLC zijn. Het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van minstens vergelijkbare zuiverheid te zijn. 2.2. Ethanol, absoluut. 2.3. 4-Hydroxybenzoëzuur. 2.4. Salicylzuur. 2.5. Benzoëzuur. 2.6. Sorbinezuur. 2.7. Natriumacetaat (CH3COONa.3H2O). 2.8. Azijnzuur, d 20 4 = 1,05 g/ml. 2.9. Acetonitril. 2.10. Zwavelzuur, 2 M. 2.11. Kaliumhydroxide, 0,2 M in water. 2.12. 2-Methoxybenzoëzuur. 2.13. Ethanol/watermengsel Meng negen volumedelen ethanol (2.2) met één volumedeel water (2.1) 2.14. Interne-standaardoplossing Bereid een oplossing van circa 1 g 2-methoxybenzoëzuur (2.12) in 500 ml ethanol/watermengsel (2.13) 2.15. Mobiele fase voor HPLC 2.15.1. Acetaatbuffer : voeg aan 1 liter water 6,35 g natriumacetaat (2.7) en 20 ml azijnzuur (2.8) toe. 2.15.2. Bereid de mobiele fase door negen volumedelen acetaatbuffer (2.15.1) te mengen met één volumedeel acetonitril (2.9). 2.16. Stamoplossing conserveermiddelen Weeg in een maatkolf van 50 ml ongeveer 0,05 g 4-hydroxybenzoëzuur (2.3), 0,2 g salicylzuur (2.4), 0,2 g benzoëzuur (2.5) en 0,05 g sorbinezuur (2.6) nauwkeurig af en vul aan met ethanol/watermengsel (2.13). Bewaar de oplossing in de koelkast. Deze oplossing is een week houdbaar. 2.17. Standaardoplossingen conserveermiddelen Breng respectievelijk 8, 4, 2, 1 en 0,5 ml van de stamoplossing (2.16) over in maatkolven van 20 ml. Voeg telkens 10 ml interne-standaardoplossing (2.14) en 0,5 ml zwavelzuur 2 M (2.10) toe.

Vul aan met ethanol/watermengsel (2.13). Deze oplossingen moeten vers worden bereid. 3. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede 3.1. Waterbad, 60 °C. 3.2. Hogedruk-vloeistofchromatograaf, voorzien van een variabele golflengte UV-detector en een injectielus van 10 |gml. 3.3. Analytische kolom Roestvrij staal, lengte 12,5-25 cm, inwendige diameter 5,6 mm, gepakt met Nucleosil 5C18, of gelijkwaardig. 3.4. Filtreerpapier, diameter 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband no. 5892, of gelijkwaardig. 3.5. Glazen buizen met schroefdop, 50 ml. 3.6. Glazen monsterflesjes (vials), 5 ml. 3.7. Kooksteentjes, carborundum, afmeting 2-4 mm, of gelijkwaardig. 4. Werkwijze 4.1. Monstervoorbereiding 4.1.1. Monstervoorbereiding zonder toevoeging van de interne standaard.

Weeg in een 50 ml glazen buis met schroefdop (3.5) 1 g van het monster af. Pipetteer 1 ml zwavelzuur 2 M (2.10) en vervolgens 40 ml ethanol/watermengsel (2.13) in de buis. Voeg circa 1 g kooksteentjes (3.7) toe, sluit de buis en schud krachtig gedurende ten minste 1 minuut tot een homogene suspensie is verkregen. Plaats de buis gedurende precies 5 minuten in een waterbad (3.1) op 60 °C om de extractie van de conserveermiddelen naar de ethanolfase te bevorderen.

Koel de buis hierna onmiddellijk onder koud stromend water en laat het extract gedurende 1 uur bij 5 °C staan.

Filtreer het extract over een papieren filter (3.4). Breng circa 2 ml van het filtraat over in een monsterflesje (3.6). Bewaar het extract bij 5° C en voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur na de bereiding van het extract uit. 4.1.2. Monstervoorbereiding met toevoeging van de interne standaard.

Weeg in een 50 ml glazen buis met schroefdop 1 + 0,1 g monster op drie cijfers na de komma af (= a g). Pipetteer 1 ml zwavelzuur 2 M (2.10) en vervolgens 30 ml ethanol/watermengsel (2.13) in de buis. Voeg circa 1 g kooksteentjes (3.7) en 10 ml interne-standaardoplossing (2.14) toe. Sluit de buis en schud krachtig gedurende tenminste 1 minuut tot een homogene suspensie is verkregen. Plaats de buis gedurende precies 5 minuten in een waterbad op 60 °C (3.1) om de extractie van de conserveermiddelen naar de ethanolfase te bevorderen. Koel de buis hierna onmiddellijk onder koud stromend water en laat het extract gedurende 1 uur bij 5 °C staan.

Filtreer het extract over een papieren filter (3.4). Breng circa 2 ml van het filtraat over in een monsterflesje (3.6). Bewaar het filtraat bij 5 °C en voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur na de bereiding van het extract uit. 4.2. HPLC Mobiele fase : acetonitril/acetaatbuffer (2.15).

Stel het debiet van de mobiele fase door de kolom in op 2 + 0,5 ml/minuut. Stel de detectorgolflengte in op 240 nm. 4.2.1. IJklijn Injecteer achtereenvolgens 10 |gml van elk van de standaard-conserveermiddeloplossingen (2.17) in de vloeistofchromatograaf (3.2). Bepaal in de verkregen chromatogrammen de verhouding tussen de piekhoogtes van de onderzochte conserveermiddelen en die van de interne standaard. Maak voor elk conserveermiddel een ijklijn door de aldus bepaalde verhoudingen uit te zetten tegen de concentratie van het conserveermiddel in de respectieve standaardoplossingen.

Controleer dat hierbij een lineaire afhankelijkheid wordt verkregen. 4.2.2. Bepaling Injecteer 10 |gml van het geëxtraheerde monster (4.1.1) in de vloeistofchromatograaf en neem het chromatogram op. Injecteer 10 |gml van één van de standaardoplossingen conserveermiddelen (2.17) en neem het chromatogram op. Vergelijk de beide chromatogrammen. Als er in het chromatogram van het monster (4.1.1) geen pieken aanwezig zijn met ongeveer dezelfde retentietijd als 2-methoxybenzoëzuur (aanbevolen interne standaard), injecteer dan 10 |gml van het extract met toegevoegde interne standaard (4.1.2) in de vloeistofchromatograaf en neem het chromatogram op.

Indien in het chromatogram van het monster (4.1.1) een piek optreedt met dezelfde retentietijd als 2-methoxybenzoëzuur, moet een andere geschikte interne standaard gekozen worden (indien één van de onderzochte conserveermiddelen niet in het chromatogram verschijnt, kan dit conserveermiddel als interne standaard gebruikt worden).

Ga na dat de met de standaardoplossingen en de monsteroplossing verkregen chromatogrammen aan de volgende voorwaarden voldoen : - de piekscheiding van het slechts gescheiden paar moet ten minste 0,90 zijn (voor een definitie van de piekscheiding zie figuur 1);

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld .

Indien de vereiste scheiding niet wordt verkregen, moet een efficiëntere kolom worden gebruikt of moet de samenstelling van de mobiele fase worden aangepast tot dit wel het geval is. - de asymmetriefactor As van alle verkregen pieken moet tussen 0,9 en 1,5 liggen (voor een definitie van de piekasymmetriefactor zie figuur 2). Voor het bepalen van de asymmetriefactor wordt aanbevolen het chromatogram met een papiersnelheid van minimaal 2 cm/minuut op te nemen;

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . - er moet een vlakke basislijn worden verkregen. 5. Berekening Bepaal met behulp van de ijkgrafiek de concentratie van de conserveermiddelen in het monster uit de verhoudingen van de piekhoogtes van de onderzochte conserveermiddelen tot die van 2-methoxybenzoëzuur (interne standaard).Bereken het gehalte aan benzoëzuur, 4-hydroxy-benzoëzuur, sorbinezuur of salicylzuur in het monster in massaprocenten (xi) met de volgende formule : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . b = concentratie (|gmg/ml) van het conserveermiddel in het monsterextract (4.1.2), zoals afgelezen uit de ijkgrafiek; a = monsterinweeg (g) (4.1.2). 6. Herhaalbaarheid (1) Bij een gehalte aan 4-hydroxybenzoëzuur van 0,40 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,035 % bedragen. Bij een gehalte aan benzoëzuur van 0,50 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,050 % bedragen.

Bij een gehalte aan salicylzuur van 0,50 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,045 % bedragen.

Bij een gehalte aan sorbinezuur van 0,60 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,035 % bedragen. 7. Opmerkingen 7.1. Uit een op de methode uitgevoerde robuustheidstest is gebleken dat de bij de extractie van de zuren uit het monster gebruikte hoeveelheid zwavelzuur kritiek is; tevens moeten de voor de op te werken hoeveelheid monster aangegeven grenzen nauwgezet worden aangehouden. 7.2 Desgewenst kan een geschikte guardkolom gebruikt worden.

C. Kwantitatieve analyse van propionzuur 1. Doel en toepassingsgebied Deze methode beschrijft de kwantitatieve analyse van propionzuur tot een maximumconcentratie van 2 % (m/m) in cosmetica.2. Definitie De volgens deze methode bepaalde propionzuurconcentratie wordt uitgedrukt als massapercentage (% m/m) van het product.3. Beginsel Na extractie van het propionzuur uit het product wordt het gehalte bepaald met behulp van gaschromatografie (GC) met 2-methylpropionzuur als interne standaard.4. Reagentia Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.Het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van gelijkwaardige kwaliteit te zijn. 4.1. Ethanol 96 % (v/v). 4.2. Propionzuur. 4.3. 2-Methylpropionzuur. 4.4. Orthofosforzuur, 10 % (m/v). 4.5. Propionzuuroplossing Weeg in een maatkolf van 50 ml circa 1 g propionzuur nauwkeurig af (= p g) en vul aan met ethanol (4.1). 4.6. Interne-standaardoplossing Weeg in een maatkolf van 50 ml circa 1 g 2-methylpropionzuur nauwkeurig af (= e g) en vul aan met ethanol (4.1). 5. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede 5.1. Gaschromatograaf met vlamionisatiedetector. 5.2. Glazen buis (20 % x 150 mm) met schroefdop. 5.3. Waterbad, 60°C. 5.4. Glazen injectiespuit, 10 ml, met membraanfilter (porindiameter 0,45 |gmm). 6. Werkwijze 6.1. Monstervoorbereiding 6.1.1. Monstervoorbereiding zonder interne standaard Weeg in een glazen buis (5.2) circa 1 g monster af. Voeg 0,5 ml orthofosforzuur (4.4) en 9,5 ml ethanol (4.1) toe. Sluit de buis en schud krachtig. Plaats de buis zonodig gedurende 5 minuten in een waterbad op 60 °C (5.3) om de vetfase volledig op te lossen. Koel snel af onder stromend water.

Filtreer een deel van de oplossing over een membraanfilter (5.4).

Chromatografeer het filtraat nog dezelfde dag. 6.1.2. Monstervoorbereiding met interne standaard Weeg in een glazen buis (5.2) 1 + 0,1 g monster tot op drie cijfers achter de komma af (= a g). Voeg 0,5 ml orthofosforzuur (4.4), 0,5 ml interne-standaardoplossing (4.6) en 9 ml ethanol (4.1) toe. Sluit de buis en schud krachtig. Plaats de buis zonodig gedurende 5 minuten in een waterbad op 60 °C (5.3) om de vetfase op te lossen. Koel snel af onder stromend water.

Filtreer een deel van de oplossing over een membraanfilter (5.4).

Chromatografeer het filtraat nog dezelfde dag. 6.2. Condities voor gaschromatografie De volgende condities worden aanbevolen : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Temperatuur Injector 200 °C Kolom 120 °C Detector 200 °C Dragergas Stikstof Debiet 25 ml/min. 6.3. Chromatografie 6.3.1. IJklijn Pipetteer in maatkolven van 20 ml respectievelijk 0,25, 0,5, 1, 2 en 4 ml propionzuuroplossing (4.5). Pipetter in elke maatkolf 1 ml interne standaardoplossing (4.6), vul aan met ethanol (4.1) en meng. De aldus verkregen oplossingen bevatten e mg/ml 2-methylpropionzuur als interne standaard (d.w.z. 1 mg/ml als e = 1,000) en p/4, p/2, p, 2p en 4p mg/ml propionzuur (d.w.z. 0,25, 0,5, 1, 2 en 4 mg/ml als p = 1,000).

Injecteer achtereenvolgens 1 |gml van elk van deze oplossingen in de gaschromatograaf en construeer de ijklijn door de verhouding van de piekoppervlaktes van propionzuur en 2-methylpropionzuur uit te zetten tegen de overeenkomstige massaverhouding.

Injecteer elke oplossing drie maal en bereken de gemiddelde verhouding van de piekoppervlakten. 6.3.2. Bepaling Injecteer 1 |gml van het volgens 6.1.1 verkregen filtraat. Vergelijk het chromatogram met dat van één van de standaardoplossingen (6.3.1).

Als er een piek aanwezig is met ongeveer dezelfde retentietijd als 2-methylpropionzuur moet een andere interne standaard gekozen worden.

Injecteer als er geen interferentie is 1 |gml van het volgens 6.1.2 bereide filtraat en bepaal de oppervlakten van de propionzuurpiek en de piek van de interne standaard.

Injecteer elke oplossing drie maal en bereken de gemiddelde verhouding van de piekoppervlakten. 7. Berekening 7.1. Lees uit de in 6.3.1 verkregen ijkgrafiek de massaverhouding (K) af die overeenkomt met de volgens 6.3.2 berekende verhouding van de piekoppervlakten. 7.2. Bereken uit de aldus verkregen massaverhouding het propionzuurgehalte van het monster (X) als massapercentage met behulp van de volgende formule : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . waarbij K = de in 7.1 gevonden verhouding; a = massa (g) afgewogen van de interne standaard (4.6); e = massa (g) van het ingewogen monster (6.1.2).

Rond de resultaten af tot op één cijfer na de komma. 8. Herhaalbaarheid (1) Bij een propionzuurgehalte van 2 % (m/m) mag het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,12 % bedragen. XXXVI. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether in cosmetica A. Identificatie 1. Doel en toepassingsgebied Deze methode beschrijft de kwalitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether (monobenzon) in huidbleekmiddelen.2. Beginsel Hydrochinon en de ethers daarvan worden aangetoond met behulp van dunne-laagchromatografie (DLC).3. Reagentia Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. 3.1. Ethanol, 96 % (v/v). 3.2. Chloroform. 3.3. Diëthylether. 3.4. Loopvloeistof Chloroform/diëthylether, 66:33 (v/v). 3.5. Ammonia, 25 % (m/m) (d 20 4 = 0,91 g/ml). 3.6. Ascorbinezuur. 3.7. Hydrochinon. 3.8. Hydrochinonmonomethylether. 3.9. Hydrochinonmonoëthylether. 3.10. Hydrochinonmonobenzylether (monobenzon). 3.11. Referentieoplossingen Onderstaande referentieoplossingen moeten vers worden bereid en zijn gedurende één dag houdbaar. 3.11.1. Weeg 0,05 g hydrochinon (3.7) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml. 3.11.2. Weeg 0,05 g hydrochinonmonomethylether (3.8) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml. 3.11.3. Weeg 0,05 g hydrochinonmonoëthylether (3.9) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml. 3.11.4. Weeg 0,05 g hydrochinonmonobenzylether (3.10) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml. 3.12. Zilvernitraat. 3.13. 12-Molybdofosforzuur. 3.14. Kaliumferrocyanide-hexahydraat. 3.15. Ferrichloride-hexahydraat. 3.16. Sproeireagentia 3.16.1. Voeg aan een 5 % (m/v) oplossing van zilvernitraat (3.12) in water ammonia (3.5) toe tot het gevormde neerslag weer oplost.

Waarschuwing : De oplossing kan na verloop van tijd ontleden en explosief worden en moet daarom na gebruik worden weggegooid. 3.16.2. 10 % (m/v) oplossing van 12-molybdofosforzuur (3.13) in ethanol (3.1). 3.16.3. Bereid een 1 % (m/v) oplossing van kaliumferrocyanide (3.14) in water en een 2 % (m/v) oplossing van ferrichloride (3.15) in water.

Meng vlak voor het gebruik gelijke delen van beide oplossingen. 4. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede 4.1. Gebruikelijke DLC-uitrusting. 4.2. DLC-platen, gebruiksklaar : silicagel GHR/UV254, 20 cm x 20 cm (Machery-Nagel of gelijkwaardig), laagdikte 0,25 mm. 4.3. Ultrasoonbad. 4.4. Centrifuge. 4.5. UV-lamp, 254 nm. 5. Werkwijze 5.1. Monstervoorbereiding Weeg 3 g monster af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling.

Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Breng de oplossing met ammonia (3.5) op een pH van 10. Vul aan met ethanol (3.1) tot 10 ml. Sluit de buis met een stop en homogeniseer gedurende 10 minuten in een ultrasoonbad. Filtreer over een papieren filter of centrifugeer bij 3 000 toeren/min. 5.2. Dunne-laagchromatografie 5.2.1. Verzadig een chromatografiebak met loopvloeistof (3.4). 5.2.2. Breng op een plaat 2 |gml van elk van de referentieoplossingen (3.11) en 2 |gml monsteroplossing (5.1) op. Ontwikkel de plaat bij kamertemperatuur in het donker, totdat het vloeistoffront een afstand van 15 cm heeft afgelegd. 5.2.3. Neem de plaat uit de bak en laat hem bij kamertemperatuur drogen. 5.3. Detectie 5.3.1. Inspecteer de plaat onder UV-licht van 254 nm en markeer de plaats van de vlekken. 5.3.2. Besproei de plaat met - zilvernitraatreagens (3.16.1), of - 12-molybdofosforzuurreagens (3.16.2) en verwarm tot circa 120 °C, of - kaliumferrocyanideoplossing en ferrichlorideoplossing (3.16.3). 6. Identificatie Bereken de Rf-waarde van de verschillende vlekken. Vergelijk de met de monsteroplossing verkregen vlekken met die van de referentieoplossingen daarbij lettend op de Rf-waarden, de kleur van de vlekken onder UV-bestraling en de kleur na zichtbaar maken met sproeireagens.

Voer de in het volgende onderdeel (B) beschreven HPLC-bepaling uit en vergelijk de met het monster verkregen retentietijden met die van de referentieoplossingen.

Bepaal aan de hand van de gecombineerde resultaten van DLC en HPLC of hydrochinon en/of ethers daarvan aanwezig zijn. 7. Opmerkingen Onder de beschreven omstandigheden werden de volgende Rf-waarden verkregen : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld B.Kwantitatieve analyse 1. Doel en toepassingsgebied Deze methode beschrijft een werkwijze voor de kwantitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether in huidbleekmiddelen.2. Beginsel Het monster wordt met een water/methanolmengsel geëxtraheerd, onder voorzichtig verwarmen om eventuele vetten te doen smelten.De kwantitatieve analyse van de te bepalen stoffen in de verkregen oplossing wordt uitgevoerd met behulp van reversed phase vloeistofchromatografie met UV-detectie. 3. Reagentia 3.1. Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van minstens gelijkwaardige zuiverheid te zijn. 3.2. Methanol. 3.3. Hydrochinon. 3.4. Hydrochinonmonomethylether. 3.5. Hydrochinonmonoëthylether. 3.6. Hydrochinonmonobenzylether (monobenzon). 3.7. Tetrahydrofuran, geschikt voor HPLC. 3.8. Water/methanolmengsel 1:1 (v/v). Meng één volumedeel water met één volumedeel methanol (3.2). 3.9. Mobiele fase : tetrahydrofuran/watermengsel 45:55 (v/v). Meng 45 volumedelen tetrahydrofuran (3.7) met 55 volumedelen water. 3.10. Standaardoplossing Weeg in een maatkolf van 50 ml 0,06 g hydrochinon (3.3), 0,08 g hydrochinonmonomethylether (3.4), 0,1 g hydrochinonmonoëthylether (3.5) en 0,12 g hydrochinonmonobenzylether (3.6) af. Los op en vul aan met methanol (3.2). Bereid de standaardoplossing door 10 ml van deze oplossing met water/methanolmengsel (3.8) tot 50 ml te verdunnen. Deze oplossingen moeten vers worden bereid. 4. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede 4.1. Waterbad, in staat de temperatuur op 60 °C te houden. 4.2. Hogedruk-vloeistofchromatograaf, voorzien van een UV-detector met variabele golflengte en een injectielus van 10 |gml. 4.3. Analytische kolom Roestvrijstalen chromatografiekolom, lengte 250 mm, inwendige diameter 4,6 mm, gepakt met Zorbax phenyl (chemisch gebonden fenethylsilaan op Zorbax SIL, end-capped met trimethylchloorsilaan), deeltjesgrootte 6 |gmm, of gelijkwaardig. Gebruik geen guardkolom, behalve een fenylguard, of gelijkwaardig. 4.4. Filtreerpapier, diameter 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband No. 5892, of gelijkwaardig. 5. Werkwijze 5.1. Monstervoorbereiding Weeg in een maatkolf van 50 ml 1 ± 0,1 g monster tot op drie cijfers achter de komma af (= a g). Dispergeer het monster in 25 ml water/methanolmengsel (3.8). Sluit de kolf en schud krachtig tot een homogene suspensie is verkregen. Schud ten minste 1 minuut. Plaats de kolf in een waterbad (4.1) bij 60 °C om de extractie te bevorderen.

Koel de kolf en vul aan met water/methanolmengsel (3.8). Filtreer het extract over een papieren filter (4.4). Voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur na bereiding van het extract uit. 5.2. HPLC 5.2.1. Stel het debiet van de mobiele fase (3.9) op 1 ml/min. en de detectorgolflengte op 295 nm in. 5.2.2. Injecteer 10 |gml van de volgens 5.1 verkregen monsteroplossing en neem het chromatogram op. Bepaal de oppervlakten van de pieken.

Voer een ijking uit als beschreven in 5.2.3. Vergelijk de chromatogrammen van het monster en de standaardoplossingen. Bepaal aan de hand van de piekoppervlakten en de responsiefactoren (RF), berekend als aangegeven in 5.2.3, de concentratie van de te analyseren stoffen in de monsteroplossing. 5.2.3. IJking Injecteer 10 |gml standaardoplossing (3.10) en neem het chromatogram op. Herhaal de meting enige malen, totdat een constante piekoppervlakte wordt verkregen.

Bepaal de responsiefactor RF : waarbij Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld .

Pi = piekoppervlakte van respectievelijk hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether; ci = concentratie (in g/50 ml) van respectievelijk hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether in de standaardoplossing (3.10);

Ga na dat de met de standaardoplossing en de monsteroplossing verkregen chromatogrammen aan de volgende voorwaarden voldoen : - de piekscheiding van het slechtst gescheiden paar moet minimaal 0,90 zijn (voor een definitie van de piekscheiding zie figuur 1);

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld .

Indien de vereiste scheiding niet wordt verkregen, moet een efficiëntere kolom worden gebruikt of moet de samenstelling van de mobiele fase worden aangepast tot dit wel het geval is. . - de asymmetriefactor As van alle verkregen pieken moet tussen 0,9 en 1,5 liggen (voor een definitie van de piekasymmetriefactor zie figuur 2). Voor het bepalen van de asymmetriefactor wordt aanbevolen het chromatogram met een papiersnelheid van minimaal 2 cm/minuut op te nemen;

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . - er moet een vlakke basislijn worden verkregen. 6. Berekening Bereken aan de hand van de piekoppervlakten de concentratie(s) van de te bepalen stof(fen) in het monster.Bereken de concentratie (xi) als massapercentage met de formule waarbij Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . a = massa (g) van het ingewogen monster; bi = piekoppervlakte van component i van het monster. 7. Herhaalbaarheid (1) 7.1. Bij een gehalte aan hydrochinon van 2 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,13 % bedragen. 7.2. Bij een gehalte aan hydrochinonmonomethylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,1 % bedragen. 7.3. Bij een gehalte aan hydrochinonmonoëthylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,11 % bedragen. 7.4. Bij een gehalte aan hydrochinonmonobenzylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,11 % bedragen. 8. Reproduceerbaarheid (2) 8.1. Bij een gehalte aan hydrochinon van 2 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,37 % bedragen. 8.2. Bij een gehalte aan hydrochinonmonomethylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,21 % bedragen. 8.3. Bij een gehalte aan hydrochinonmonoëthylether van 1,0 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,19 % bedragen. 8.4. Bij een gehalte aan hydrochinonmonobenzylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,11 % bedragen. 9. Opmerkingen 9.1. Wanneer een hydrochinongehalte van aanzienlijk meer dan 2 % wordt gevonden en een nauwkeurige gehaltebepaling vereist is, dient het monsterextract (5.1) te worden verdund tot de concentratie ongeveer zodanig is als met een monster dat 2 % hydrochinon bevat, zou worden verkregen, waarna de bepaling wordt herhaald. (Bij sommige apparatuur kan de extinctie bij hoge hydrochinonconcentraties buiten het lineaire gebied van de detector uitvallen). 9.2 Storingen Met de hierboven beschreven methode kunnen hydrochinon en de ethers daarvan in een enkele isocratische analyse worden bepaald. Door het gebruik van een fenylkolom wordt een voldoende retentie voor hydrochinon verkregen, hetgeen niet kan worden gegarandeerd wanneer een C18-kolom met de beschreven mobiele fase wordt gebruikt.

Deze methode is echter gevoelig voor storing door een aantal parabenen. Treedt een dergelijke storing op, dan moet de bepaling herhaald worden met een andere mobiele fase/stationaire fasesysteem.

Geschikte methoden staan beschreven in de referenties (3) en (4) namelijk, kolom : Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 cm, of gelijkwaardig temperatuur : 36 °C debiet : 1,5 ml/min. mobiele fase : voor hydrochinon : methanol/water 5:95 (v/v) voor hydrochinonmonomethylether : methanol/water 30:70 (v/v) voor hydrichononmonobenzylether : methanol/water 80:20 (v/v) kolom : Spherisorb S5-ODS, of gelijkwaardig mobiele fase : water/methanol 90:10 (v/v) debiet : 1,5 ml/min.

Deze condities zijn geschikt voor hydrochinon.

XXXVII. Identificatie en gehaltebepaling van 2-fenoxyethanol, 1-fenoxypropaan-2-ol, methyl-, ethyl-, propyl-, butyl- en benzyl-4-hydroxybenzoaat in cosmetica 1. Doel en toepassingsgebied Deze methode beschrijft een DLC-procedure waarmee, in combinatie met de in onderdeel B beschreven kwantitatieve analysemethode, de aanwezigheid van 2-fenoxyethanol, 1-fenoxypropaan-2-ol, methyl-4-hydroxybenzoaat, ethyl-4-hydroxybenzoaat, propyl-4-hydroxybenzoaat, butyl-4-hydroxybenzoaat en benzyl-4-hydroxybenzoaat in cosmetica kan worden aangetoond.2. Beginsel De conserveermiddelen worden met aceton uit het aangezuurde cosmetische monster geëxtraheerd.Na filtratie wordt de acetonoplossing met water gemengd, waarna de vetzuren in alkalisch milieu als calciumzouten worden neergeslagen. Het alkalische aceton/watermengsel wordt met diëthylether geëxtraheerd om lipofiele stoffen te verwijderen. Na aanzuren worden de conserveermiddelen met diëthylether geëxtraheerd. Een aliquot van het diëthylether-extract wordt op een met silicagel gecoate dunnelaagplaat gebracht. Na ontwikkeling van de plaat wordt het verkregen chromatogram onder UV-licht bekeken en met Millon's reagens zichtbaar gemaakt. 3. Reagentia 3.1. Algemeen Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van minstens gelijkwaardige zuiverheid te zijn. 3.2. Aceton. 3.3. Diëthylether. 3.4. n-Pentaan. 3.5. Methanol. 3.6. IJsazijn. 3.7. Zoutzuur, c(HCl)=4 mol/l. 3.8. Kaliumhydroxideoplossing c(KOH)=4 mol/l. 3.9. Calciumchloride-dihydraat (CaCl2.2H2O). 3.10. Detectiereagens : Millon's reagens.

Millon's reagens (kwik(II)nitraat) is een in de handel verkrijgbare gebruiksklare oplossing (Fluka 69820). 3.11. 2-Fenoxyethanol. 3.12. 1-Fenoxypropaan-2-ol. 3.13. Methyl-4-hydroxybenzoaat (methylparaben). 3.14. Ethyl-4-hydroxybenzoaat (ethylparaben). 3.15. n-Propyl-4-hydroxybenzoaat (propylparaben). 3.16. n-Butyl-4-hydroxybenzoaat (butylparaben). 3.17. Benzyl-4-hydroxybenzoaat (benzylparaben). 3.18. Referentieoplossingen Bereid 0,1 %-ige (m/V) oplossingen van elk van de referentiestoffen 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 en 3.17 in methanol. 3.19. Loopvloeistof Meng 88 volumedelen n-pentaan met 12 volumedelen ijsazijn. 4. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede 4.1. waterbad, geschikt voor een temperatuur van 60 °C; 4.2. chromatografietank (zonder filtreerpapierbekleding); 4.3. UV-lamp, 254 nm; 4.4. DLC-platen, 20 cm X 20 cm, voorzien van een 0,25 mm laag silicagel 60 F254, met concentratiezone (Merck Nr. 11798, Darmstadt, of gelijkwaardig); 4.5. oven, geschikt voor een temperatuur van 105 °C; 4.6. föhn; 4.7. wollen verfroller, lengte circa 10 cm, buitendiameter circa 3,5 cm. De wollaag moet 2 tot 3 mm dik zijn. Zo nodig wordt de wol bijgesneden.

Zie de opmerking in punt 5.2. 4.8. glazen buizen, 50 ml, met schroefdop. 4.9. elektrische kookplaat met thermostaat. Temperatuurinstelling : circa 80 °C. De kookplaat wordt bedekt met een aluminiumplaat van 20 cm X 20 cm en een dikte van circa 6 mm om een gelijkmatige warmteverdeling te verkrijgen. 5. Werkwijze 5.1. Monstervoorbereiding Weeg circa 1 g monster in een 50 ml glazen buis met schroefdop. Voeg vier druppels zoutzuur (punt 3.7) en 40 ml aceton toe.

In geval van sterk alkalische cosmetica, zoals toiletzeep, worden 20 druppels zoutzuur toegevoegd. Sluit de buis, verwarm het mengsel voorzichtig tot circa 60 °C om de extractie van de conserveermiddelen in de acetonfase te vergemakkelijken en schud krachtig gedurende één minuut.

Bepaal de pH van de oplossing met pH-papier en zuur de oplossing aan met zoutzuur tot de pH < 3 is. Schud krachtig gedurende één minuut.

Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en filtreer over een papieren filter in een erlenmeyer. Breng 20 ml van het filtraat over in een 200 ml-erlenmeyer, voeg 60 ml water toe en meng. Breng de pH van het mengsel met kaliumhydroxideoplossing (punt 3.8) op ongeveer 10 onder gebruikmaking van pH-papier.

Voeg 1 g calciumchloride-dihydraat (punt 3.9) toe en schud krachtig.

Filtreer de oplossing over een papieren filter in een 250 ml-scheitrechter die 75 ml diëthylether bevat en schud krachtig gedurende één minuut. Wacht tot de fasen gescheiden zijn en vang de waterlaag op in een 200 ml-erlenmeyer.

Breng de pH van de oplossing met zoutzuur op ongeveer 2 onder gebruikmaking van pH-papier. Voeg vervolgens 10 ml diëthylether toe en schud krachtig gedurende één minuut. Wacht tot de fasen gescheiden zijn en breng circa 2 ml van de diëthyletherlaag over in een 5 ml-monsterflesje. 5.2. Dunnelaagchromatografie Leg een DLC-plaat (punt 4.4) op de verwarmde aluminiumplaat (punt 4.9). Breng op de startlijn in de concentratiezone van de DLC-plaat 10 ml van elk van de referentieoplossingen (punt 3.18) en 100 ml van de monsteroplossing(en) (punt 5.1) op.

Desgewenst kan de verdamping van het oplosmiddel met een luchtstroom worden bevorderd. Neem de DLC-plaat van de verwarmingsplaat af en laat afkoelen tot kamertemperatuur.

Breng 100 ml van de loopvloeistof (punt 3.19) in de chromatografietank (punt 4.2). Plaats de DLC-plaat onmiddellijk in de onverzadigde tank en ontwikkel bij kamertemperatuur totdat het vloeistoffront een afstand van ongeveer 15 cm vanaf de basislijn heeft afgelegd. Neem de plaat uit de chromatografietank en droog de plaat met behulp van een föhn in een stroom hete lucht.

Bekijk de plaat onder UV-licht (punt 4.3) en markeer de positie van de vlekken. Verwarm de plaat gedurende 30 minuten in een oven (punt 4.5) op 100 °C om overtollig azijnzuur te verwijderen. Maak de conserveermiddelen zichtbaar met Millon's reagens (punt 3.10) door de verfroller (punt 4.7) in het reagens te dopen en over de DLC-plaat te rollen totdat deze gelijkmatig gevochtigd is.

Opmerking : Als alternatief kunnen de vlekken zichtbaar worden gemaakt door op elk van de onder UV-licht gemarkeerde vlekken een druppel Millon's reagens te brengen.

Esters van 4-hydroxybenzoëzuur verschijnen als rode vlekken, 2 fenoxyethanol en 1-fenoxypropaan-2-ol als gele vlekken. Er wordt echter op gewezen dat 4-hydroxybenzoëzuur zelf, dat in de monsters aanwezig kan zijn als conserveermiddel of als ontledingsproduct van de parabenen, ook als rode vlek verschijnt. Zie de punten 7.3 en 7.4. 6. Identificatie Bereken de Rf-waarde van alle vlekken.Vergelijk de bij de monsteroplossing verkregen vlekken met die van de referentieoplossingen, daarbij lettend op de Rf-waarden, het gedrag onder UV-bestraling en de kleur na zichtbaar maken. Trek een voorlopige conclusie omtrent de identiteit van de conserveermiddelen.

Als er parabenen aanwezig lijken te zijn, moet de HPLC-methode zoals beschreven in onderdeel B worden uitgevoerd. Combineer de resultaten van DLC en HPLC om de aanwezigheid van 2-fenoxyethanol, 1-fenoxypropaan-2-ol en de parabenen te bevestigen. 7. Opmerkingen 7.1. In verband met de giftigheid van Millon's reagens kan dit het best volgens één van de beschreven methoden worden opgebracht.

Sproeien wordt niet aanbevolen. 7.2. Andere verbindingen die hydroxylgroepen bevatten kunnen met Millon's reagens ook kleuren te zien geven. Een tabel met de kleuren en Rf-waarden voor een aantal conserveermiddelen, zoals die met deze DLC-methode worden verkregen, is opgenomen in : N. de Kruijf, M.A.H. de Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1987) : Determination of preservatives in cosmetic products I : Thin layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatoghraphy 410, blz. 395-411). 7.3. De onderstaande Rf-waarden dienen als indicatie voor de waarden die kunnen worden verkregen.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 7.4. Er wordt geen scheiding verkregen tussen 4-hydroxybenzoëzuur en methylparaben, evenmin als tussen benzylparaben en ethylparaben. De identificatie van deze verbindingen moet worden bevestigd met behulp van de in onderdeel B beschreven HPLC-methode door vergelijking van de verkregen retentietijden met die van de standaarden.

B. Gehaltebepaling 1. Doel en toepassingsgebied Deze methode beschrijft een werkwijze voor de gehaltebepaling van 2-fenoxyethanol, 1-fenoxypropaan-2-ol, methyl-4-hydroxybenzoaat, ethyl-4-hydroxybenzoaat, propyl-4-hydroxybenzoaat, butyl-4-hydroxybenzoaat en benzyl-4-hydroxybenzoaat in cosmetica.2. Definitie De volgens deze methode bepaalde gehaltes aan conserveermiddelen worden uitgedrukt als massapercentage.3. Beginsel Het monster wordt aangezuurd met zwavelzuur en vervolgens gesuspendeerd in een ethanol/watermengsel.Na voorzichtig verwarmen van het mengsel om de vetfase te smelten, teneinde kwantitatieve extractie te bevorderen, wordt het mengsel gefiltreerd. De conserveermiddelen in het filtraat worden bepaald met behulp van reversed-phase HPLC, waarbij isopropyl-4-hydroxybenzoaat gebruikt wordt als interne standaard. 4. Reagentia 4.1. Algemeen Alle reagentia moeten van analysekwaliteit en, waar van toepassing, geschikt voor HPLC zijn. Het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van minstens gelijkwaardige zuiverheid te zijn. 4.2. Ethanol, absoluut. 4.3. 2-Fenoxyethanol. 4.4. 1-Fenoxypropaan-2-ol. 4.5. Methyl-4-hydroxybenzoaat (methylparaben). 4.6. Ethyl-4-hydroxybenzoaat (ethylparaben). 4.7. n-Propyl-4-hydroxybenzoaat (propylparaben). 4.8. Isopropyl-4-hydroxybenzoaat (isopropylparaben). 4.9. n-Butyl-4-hydroxybenzoaat (butylparaben). 4.10. Benzyl-4-hydroxybenzoaat (benzylparaben). 4.11. Tetrahydrofuran. 4.12. Methanol. 4.13. Acetonitril. 4.14. Verdund zwavelzuur, c(H2SO4)=2 mol/l. 4.15. Ethanol/Watermengsel Meng negen volumedelen ethanol (punt 4.2) met één volumedeel water. 4.16. Interne-standaardoplossing Weeg circa 0,25 g isopropylparaben (punt 4.8) nauwkeurig af, breng dit kwantitatief over in een maatkolf van 500 ml, los op en vul aan tot de streep met ethanol/watermengsel (punt 4.15). 4.17. Mobiele fase : tetrahydrofuran/water/methanol/acetonitrilmengsel Meng vijf volumedelen tetrahydrofuran, 60 volumedelen water, tien volumedelen methanol en 25 volumedelen acetonitril. 4.18. Stamoplossing conserveermiddelen Weeg nauwkeurig circa 0,2 g 2-fenoxyethanol, 0,2 g 1-fenoxypropaan-2-ol, 0,05 g methylparaben, 0,05 g ethylparaben, 0,05 g propylparaben, 0,05 g butylparaben en 0,025 g benzylparaben af in een maatkolf van 100 ml, los op en vul aan tot de streep met ethanol/watermengsel.

Bewaard in de koelkast is deze oplossing een week houdbaar. 4.19. Standaardoplossingen conserveermiddelen Breng respectievelijk 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml en 1,00 ml stamoplossing (punt 4.18) in maatkolven van 50 ml. Voeg telkens 10,00 ml interne-standaardoplossing (punt 4.16) en 1,0 ml verdund zwavelzuur (punt 4.14) toe en vul aan tot de streep met ethanol/watermengsel.

Deze oplossingen moeten vers bereid worden. 5. Apparatuur Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede : 5.1. waterbad, geschikt voor een temperatuur van 60 °C ± 1 °C; 5.2. HPLC-apparaat, voorzien van een UV-detector, golflengte : 280 nm; 5.3. analytische kolom : Roestvrij staal, 25 cm x 4,6 mm inwendige diameter (of 12,5 cm x 4,6 mm), gevuld met Nucleosil 5C18 of gelijkwaardig (zie punt 10.1); 5.4. glazen buizen, 100 ml, met schroefdop; 5.5. kooksteentjes, carborundum, afmeting 2-4 mm, of gelijkwaardig. 6. Werkwijze 6.1. Monstervoorbereiding 6.1.1. Monstervoorbereiding zonder toevoeging van interne standaard Weeg in een glazen buis van 100 ml met schroefdop circa 1,0 g monster af. Pipetteer 1,0 ml verdund zwavelzuur (punt 4.14) en 50,0 ml ethanol/watermengsel (punt 4.15) in de buis. Voeg circa 1 g kooksteentjes (punt 5.5) toe, sluit de buis en schud krachtig tot een homogene suspensie is verkregen.

Schud ten minste één minuut. Plaats de buis gedurende vijf minuten in een waterbad (punt 5.1) op 60 °C ± 1 °C om de extractie van de conserveermiddelen in de ethanolfase te vergemakkelijken.

Koel de buis onmiddellijk onder koud stromend water en plaats het extract gedurende één uur in de koelkast. Filtreer het extract over een papieren filter. Breng circa 2 ml van het filtraat over in een monsterflesje van 5 ml. Bewaar de extracten in de koelkast en voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur uit. 6.1.2. Monstervoorbereiding met toevoeging van interne standaard Weeg in een glazen buis van 100 ml met schroefdop tot op drie decimale plaatsen 1,0 g ± 0,1 g monster af (= a g). Pipetteer 1,0 ml verdund zwavelzuur en 40,0 ml ethanol/watermengsel in de buis. Voeg circa 1 g kooksteentjes en exact 10,00 ml interne-standaardoplossing toe. Sluit de buis en schud krachtig tot een homogene suspensie is verkregen.

Schud tenminste één minuut. Plaats de buis gedurende vijf minuten in een waterbad op 60 °C ± 1 °C om de extractie van de conserveermiddelen in de ethanolfase te vergemakkelijken.

Koel de buis onmiddellijk onder koud stromend water en plaats het extract gedurende één uur in de koelkast. Filtreer het extract over een papieren filter. Breng circa 2 ml van het filtraat over in een monsterflesje van 5 ml (proefoplossing). Bewaar de extracten in de koelkast en voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur uit. 6.2. HPLC 6.2.1. Chromatografie - Mobiele fase : tetrahydrofuran/water/methanol/acetonitril mengsel (punt 4.17). - Debiet : 1,5 ml/minuut. - Detectiegolflengte : 280 nm. 6.2.2. IJking Injecteer achtereenvolgens 10 ml van elk van de conserveermiddel-standaardoplossingen (punt 4.19). Bepaal in de verkregen chromatogrammen de verhouding tussen de piekhoogtes van de conserveermiddel-standaardoplossingen en die van de interne standaard.

Maak voor elk conserveermiddel een ijkgrafiek door de aldus bepaalde verhouding uit te zetten tegen de concentratie van het conserveermiddel in de standaardoplossing. 6.2.3. Bepaling Injecteer 10 ml van de monsteroplossing zonder interne standaard (punt 6.1.1) in de chromatograaf en neem het chromatogram op.

Injecteer 10 ml van één van de conserveermiddel-standaardoplossingen (punt 4.19) en neem het chromatogram op. Vergelijk de verkregen chromatogrammen. Komt in het chromatogram van het monsterextract (punt 6.1.1) geen piek voor met ongeveer dezelfde retentietijd als isopropylparaben (de aanbevolen interne standaard), injecteer dan 10 ml monsteroplossing met interne standaard (punt 6.1.2). Neem het chromatogram op en meet de piekhoogtes.

Als in het chromatogram van de monsteroplossing een storende piek aanwezig is met ongeveer dezelfde retentietijd als isopropylparaben, moet een andere interne standaard worden gekozen. Als één van de onderzochte conserveermiddelen niet in het chromatogram van het monster voorkomt, kan dit als alternatieve interne standaard gebruikt worden.

Bereken de verhoudingen van de piekhoogtes van de onderzochte conserveermiddelen tot die van de interne standaard.

Ga na of voor de standaardoplossingen bij de ijking een lineaire afhankelijkheid wordt verkregen.

Ga na of de met de standaardoplossing en de monsteroplossing verkregen chromatogrammen aan de volgende voorwaarden voldoen : - De piekscheiding van het slechts gescheiden paar moet minimaal 0,90 zijn (voor de definitie van de piekscheiding zie figuur 1).

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . p = f/g.

Indien de vereiste scheiding niet wordt verkregen moet er of een efficiëntere kolom worden gebruikt of moet de samenstelling van de mobiele fase worden aangepast totdat dit wel het geval is. - De asymmetriefactor As van alle verkregen pieken moet tussen 0,9 en 1,5 liggen (voor een definitie van de piekasymmetriefactor zie figuur 2). Voor het bepalen van de asymmetriefactor wordt aanbevolen het chromatogram met een papiersnelheid van minimaal 2 cm/minuut op te nemen, Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . 7. Berekening Bereken uit de verhoudingen van de piekhoogtes van de onderzochte conserveermiddelen tot die van de interne standaard met behulp van de ijkgrafiek (punt 6.2.2) de concentratie van de conserveermiddelen in de monsteroplossing. Bereken het gehalte aan 2-fenoxyethanol, 1-fenoxypropaan-2-ol, methyl-4-hydroxybenzoaat, ethyl-4-hydroxybenzoaat, propyl-4-hydroxybenzoaat, butyl-4-hydroxybenzoaat en benzyl-4-hydroxybenzoaat, wi, als massapercentage (% m/m) met behulp van de volgende formule : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld . waarbij bi = concentratie van het conserveermiddel i in de proefoplossing in microgram per milliliter, zoals afgelezen uit de ijgrafiek, en a = monsterinweeg in gram. 8. Herhaalbaarheid (1) Zie de opmerkingen in punt 10.5. 9. Reproduceerbaarheid (1) Zie de opmerkingen in punt 10.5. 10. Opmerkingen 10.1. Stationaire fase Het retentiegedrag bij HPLC-bepalingen hangt sterk af van het soort, het merk en de voorgeschiedenis van de stationaire fase. Of een kolom geschikt is voor de scheiding van de bestudeerde conserveermiddelen, kan worden opgemaakt uit de resultaten die met de standaardoplossingen worden verkregen (zie de opmerkingen in punt 6.2.3). Naast de voorgestelde kolompakking zijn ook Hypersil ODS en Zorbax ODS geschikt gebleken.

Eventueel kan de samenstelling van de mobiele fase worden geoptimaliseerd om de vereiste scheiding te verkrijgen. 10.2. Detectiegolflengte Uit een robuustheidstest die op de beschreven methode is uitgevoerd, is gebleken dat een geringe verandering in de detectiegolflengte een aanzienlijk effect op de resultaten van de bepaling kan hebben. Daarom moet deze parameter bij de analyse zorgvuldig worden gecontroleerd. 10.3. Storingen Onder de in deze methode beschreven condities worden ook tal van andere verbindingen, zoals conserveermiddelen en cosmetica-additieven, geëlueerd. Een overzicht van de retentietijden van een groot aantal conserveermiddelen die vermeld staan in bijlage VI bij de richtlijn van de Raad inzake cosmetica, is opgenomen in : N. De Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi and A. Schouten (1987) : Determination of preservatives in cosmetic products II : High performance liquid chromatographic identification. (J. Chromatography 469, blz. 317-398). 10.4. Ter bescherming van de analytische kolom kan een geschikte guardkolom worden gebruikt. 10.5. De methode is onderzocht in een ringonderzoek waaraan negen laboratoria hebben deelgenomen. Hierbij zijn drie monsters geanalyseerd. De onderstaande tabel geeft voor elk van die drie monsters het gemiddelde gehalte als massapercentage (m), de herhaalbaarheid (r) en de reproduceerbaarheid (R) van de daarin aanwezige analyten.

Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Ons bekend om te worden gevoegd bij Ons besluit van 16 april 1998.

ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid en Pensioenen, M. COLLA

(1) Volgens ISO 5725.(2) Volgens ISO 5725.(3) M.Herpol-Borremans en M.O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau, Int. J. Cosmet. Sci. 8, 203-214 (1986). (4) J.Firth and I. Rix. Determination of Hydriquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.