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Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de bestrijding van paardenpest
SERVICE PUBLIC FEDERAL SANTE PUBLIQUE, SECURITE DE LA CHAINE ALIMENTAIRE ET ENVIRONNEMENT 28 JUIN 2009. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et A venir, Salut. Vu la loi du 24 mars 1987 relative A la santé des animaux, l'article FEDERALE OVERHEIDSDIENST VOLKSGEZONDHEID, VEILIGHEID VAN DE VOEDSELKETEN EN LEEFMILIEU 28 JUNI 2009. - Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de bestrijding van paardenpest ALBERT II, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet. Gelet op de dierengezondheidswet van 24 maart 1987, artikel 9, 5°,
9, 5°, modifié par la loi du 28 mars 2003; gewijzigd bij de wet van 28 maart 2003;
Vu l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la Gelet op het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de
peste équine; bestrijding van paardenpest;
Considérant la Directive 90/426/CEE du Conseil du 26 juin 1990 Overwegende de Richtlijn 90/426/EEG van de Raad van 26 juni 1990 met
betrekking tot vaststelling van veterinairrechtelijke voorschriften
relative aux conditions de police sanitaire régissant les mouvements voor het verkeer van paardachtigen en de invoer van paardachtigen uit
d'équidés en provenance des pays tiers, annexe D; derde landen, bijlage D;
Considérant la Décision 2002/160/CE de la Commission du 21 février Overwegende de Beschikking 2002/160/EG van de Commissie van 21
2002 modifiant l'annexe D de la Directive 90/426/CEE du Conseil februari 2002 tot wijziging van bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG van
concernant les tests de diagnostic de la peste équine; de Raad met betrekking tot de diagnostische tests voor paardenpest;
Vu l'avis de l'Inspecteur des Finances, donné le 20 août 2008; Gelet op het advies van de Inspecteur van Financiën, gegeven op 20
augustus 2008;
Vu l'avis 45.598/3 du Conseil d'Etat, donné le 3 mars 2009, en Gelet op advies 45.598/3 van de Raad van State, gegeven op 3 maart
application de l'article 84, § 1er, 1°, des lois sur le Conseil 2009, met toepassing van artikel 84, § 1, eerste lid, van de wetten op
d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973; de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973;
Sur la proposition de la Ministre de la Santé publique et de la Op de voordracht van de Minister van Volksgezondheid en de Minister
Ministre de l'Agriculture, van Landbouw,
Nous avons arrêté et arrêtons : Hebben Wij besloten en besluiten Wij :

Article 1er.Dans l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte

Artikel 1.In het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende
contre la peste équine, l'annexe 1 est remplacée par l'annexe jointe de bestrijding van paardenpest wordt de bijlage 1 vervangen door de
au présent arrêté. bijlage gevoegd bij dit besluit.

Art. 2.La Ministre qui a la Santé publique dans ses attributions et

Art. 2.De Minister bevoegd voor Volksgezondheid en de Minister
la Ministre qui a l'Agriculture dans ses attributions sont chargées, bevoegd voor Landbouw zijn, ieder wat hem betreft, belast met de
chacune en ce qui la concerne, de l'exécution du présent arrêté. uitvoering van dit besluit.
Donné A Bruxelles, le 28 juin 2009. Gegeven te Brussel, 28 juni 2009.
ALBERT ALBERT
Par le Roi : Van Koningswege :
La Ministre de la Santé publique, De Minister van Volksgezondheid,
Mme L. ONKELINX Mevr. L. ONKELINX
La Ministre de l'Agriculture, De Minister van Landbouw,
Mme S. LARUELLE Mevr. S. LARUELLE
Annexe A l'arrêté royal du 28 juin 2009 modifiant l'arrêté royal du 26 Bijlage bij het koninklijk besluit van 28 juni 2009 tot wijziging van
janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine DIAGNOSTIC DE LA PESTE EQUINE Les réactifs pour les techniques immuno-enzymatiques (ELISA) décrites ci-dessous peuvent être obtenus auprès du laboratoire communautaire de référence ou des laboratoires de référence de l'OIE pour la peste équine. 1. TEST ELISA DE COMPETITION POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test ELISA de compétition est utilisé pour détecter la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce d'équidés. L'antisérum de cobaye contre le VPE, ci-après dénommé "antisérum de cobaye", est un antisérum A large spectre, polyclonal et immun; il est spécifique du sérogroupe PE et permet de détecter tous les sérotypes connus du virus de cette maladie. Le principe du test est une diminution de la réaction entre l'antigène du VPE et un antisérum de cobaye par un échantillon de sérum A tester. Les anticorps du VPE dans l'échantillon de sérum A tester seront en compétition avec ceux de l'antisérum de cobaye, ce qui entraînera une réduction de la couleur attendue (après ajout d'un anticorps anticobaye marqué par un enzyme et du substrat). Les sérums peuvent être testés A une seule dilution de 1/5 (méthode du test ponctuel) ou het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de bestrijding van paardepest DIAGNOSE VAN PAARDENPEST Reagentia voor de hieronder beschreven enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kunnen worden bekomen bij het communautaire referentielaboratorium of de referentielaboratoria van het OIE voor paardenpest. 1. COMPETITIE-ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST) De competitie-ELISA wordt gebruikt voor het aantonen van specifieke antilichamen tegen AHSV in sera van paardachtigen. Het breedspectrum, polyklonaal, anti-AHSV caviaserum is serogroepspecifiek en is geschikt voor het aantonen van antilichamen gericht tegen alle bekende serotypes van het paardenpestvirus. De test is gebaseerd op het onderbreken van de reactie tussen het AHSV-antigeen en een anti-AHSV caviaserum door AHSV-antilichamen in een testserummonster. AHSV-antilichamen in het testserummonster gaan competitie aan met de AHSV-antilichamen in het caviaserum, wat resulteert in vermindering van de kleurontwikkeling (na toevoeging van met een enzyme gelabelled anticavia-antilichaam en substraat). De sera kunnen worden getest bij een enkele verdunning van 1 op 5
être titrés (méthode de titrage du sérum), pour donner les points (spottestmethode) of kunnen worden getitreerd voor het verkrijgen van
terminaux de dilution. Des valeurs d'inhibition supérieures A 50 % verdunningseindpunten. Inhibitiewaarden van meer dan 50 % kunnen als
peuvent être considérées comme positives. positief worden beschouwd.
Le protocole du test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire Het hieronder beschreven testprotocol wordt gebruikt in het regionaal
régional de référence pour la peste équine de Pirbright, Royaume-Uni. referentielaboratorium voor paardenpest in Pirbright, Verenigd Koninkrijk.
1.1. Description du test 1.1. Testprocedure
1.1.1. Préparation des plaques 1.1.1. Voorbereiding van de plaatjes
1.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de l'antigène du VPE extrait de 1.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met AHSV-antigeen dat is geëxtraheerd
cultures de cellules infectées, dilué dans un tampon uit geïnfecteerde celculturen en verdund in
carbonate-bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques ELISA pendant une nuit A 4 °C. carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Incubeer de ELISA-plaatjes bij 4 °C gedurende één nacht.
1.1.1.2. Laver les plaques trois fois par rinçage et vider les puits 1.1.1.2. Was de plaatjes driemaal door de putjes te vullen met PBS (pH
avec une solution saline tamponnée au phosphate (SSTP) de pH 7,2-7,4, 7,2-7,4) en vervolgens weer leeg te slaan, en sla de plaatjes droog op
puis sécher au buvard. absorberend papier.
1.1.2. Puits de contrôle 1.1.2. Controleputjes
1.1.2.1. Titrer les sérums de contrôle positifs dans une série de 1.1.2.1. Titreer de positieve controlesera in een tweevoudige
dilutions de 2 en 2, de 1/5 A 1/640, dans la colonne 1, dans un tampon verdunningsreeks, 1 op 5 tot 1 op 640, in kolom 1 in blockingbuffer
de blocage SSTP contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20, 5,0 % (m/v) de (PBS met 0,05 % (v/v) Tween-20, 5 % (w/v) mageremelkpoeder (Cadbury's
lait écrémé en poudre (Cadbury's MarvelTM) et 1 % (v/v) de sérum bovin MarvelTM) en 1 % (v/v) serum van een volwassen rund) tot een
adulte, afin d'obtenir un volume final de 50 µl par puits. eindvolume van 50 µl per putje.
1.1.2.2. Ajouter 50 µl de sérum de contrôle négatif A une dilution de 1.1.2.2. Pipetteer 50 µl van het negatieve controleserum in een
1/5 (10 µl de sérum + 40 µl de tampon de blocage) aux puits A et B de verdunning 1 op 5 (10 µl serum + 40 µl blockingbuffer) in de putjes A
la colonne 2. en B van kolom 2.
1.1.2.3. Ajouter 100 µl par puits de tampon de blocage aux puits C et 1.1.2.3. Pipetteer 100 µl blockingbuffer in de putjes C en D van kolom
D de la colonne 2 (CONTROLE A BLANC). 2 (BLANCO).
1.1.2.4. Ajouter 50 µl de tampon de blocage aux puits E, F, G et H de 1.1.2.4. Pipetteer 50 µl blockingbuffer in de putjes E, F, G en H van
la colonne 2 (contrôle sérum de cobaye). kolom 2 (caviaserum controle).
1.1.3. Méthode du test ponctuel 1.1.3. Spottestmethode
1.1.3.1. Ajouter au tampon de blocage une dilution A 1/5 de chaque 1.1.3.1. Pipetteer een verdunning van elk testserum in blockingbuffer
sérum A tester afin de doubler les puits des colonnes 3 A 12 (sérums (verhouding 1 op 5) in duplo (twee putjes/monster) van de kolommen 3
de 10 µl + 40 µl de tampon de blocage). tot en met 12 (10 µl serum + 40 µl blockingbuffer).
ou of
1.1.4. Méthode de titrage du sérum 1.1.4. Serumtitreringsmethode
1.1.4.1. Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de chaque 1.1.4.1. Bereid een tweevoudige verdunningsreeks van elk testserum (1
échantillon A tester (de 1/5 A 1/640) dans un tampon de blocage dans op 5 tot 1 op 640) in blockingbuffer en pipetteer deze in 8 putjes van
huit puits de chacune des colonnes 3 A 12. een kolom (een verdunningsreeks per kolom: kolommen 3 tot en met 12).
ensuite vervolgens
1.1.5. Ajouter 50 µl d'antisérum de cobaye, préalablement dilué dans 1.1.5. Pipetteer 50 µl anti-AHSV caviaserum, reeds voorverdund tot de
le tampon de blocage, A l'ensemble des puits, excepté les puits DE eindverdunning in blockingbuffer, in alle putjes van de ELISA-plaat,
CONTROLE A BLANC de la plaque ELISA (tous les puits contiennent A présent un volume final de 100 µl). behalve de blanco's (elk putje bevat nu 100 µl vloeistof).
1.1.5.1. Incuber pendant 1 heure A 37 °C dans un agitateur rotatif. 1.1.5.1. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C op een schudapparaat.
1.1.5.2. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment. 1.1.5.2. Was de plaatjes driemaal en sla droog als hierboven omschreven.
1.1.5.3. Ajouter A chaque puits 50 µl de sérum de lapin anticobaye 1.1.5.3. Pipetteer 50 µl konijn-anticavia-HRP-conjugaat, reeds
conjugué A de la peroxydase de raifort, préalablement dilué dans un tampon de blocage. voorverdund tot de eindverdunning in blocking-buffer, in elk putje.
1.1.5.4. Incuber pendant 1 heure A 37 °C dans un agitateur rotatif. 1.1.5.5. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C op een schudapparaat.
1.1.5.4. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment. 1.1.5.5. Was de plaatjes driemaal en sla droog als hierboven omschreven.
1.1.6. Chromogène 1.1.6. Chromogeen
Préparer la solution chromogène OPD (OPD = orthophényldiamine) selon Bereid de chromogeenoplossing OPD (OPD=ortho-phenyldiamine) volgens de
les instructions du fabricant (0,4 mg/ml dans de l'eau distillée instructies van de fabrikant (0,4 mg per ml in steriel gedistilleerd
stérile) juste avant de l'utiliser. Ajouter un substrat (peroxyde water) enkele minuten vóór het gebruik. Voeg substraat (H2O2,
d'hydrogène = H2O2), afin d'obtenir une concentration finale de 0,05 % waterstofperoxide) toe tot een eindconcentratie van 0,05 % (v/v)
(v/v) (1/2000 d'une solution A 30 % de H2O2). Ajouter 50 µl de la (verdunning van 1 op 2 000 van een 30 %-ige oplossing van H2O2).
solution OPD A chaque puits et laisser les plaques sur la paillasse Pipetteer 50 µl OPD-oplossing in elk putje en laat de plaatjes
pendant 10 minutes A température ambiante. Stopper la réaction en gedurende 10 minuten bij omgevingstemperatuur staan. Stop de reactie
ajoutant 50 µl par puits d'acide sulfurique 1M (H2SO4). met 1M zwavelzuur (H2SO4) (50 µl per putje).
1.1.7. Lecture 1.1.7. Aflezen
Lecture par spectrophotométrie A 492 nm. Lees af met behulp van een spectrofotometer bij een golflengt van 492 nm.
1.2. Expression des résultats 1.2. Berekening van de resultaten
1.2.1. A l'aide éventuelle d'un logiciel, déterminer les valeurs de 1.2.1. Print de OD-waarden en het percentage inhibitie (PI) voor de
densité optique (DO) et le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums A
tester et des sérums de contrôle, sur la base de la valeur moyenne testsera en controlesera, gebaseerd op de gemiddelde waarde van de
enregistrée dans les quatre puits contenant les sérums-contrôles de vier caviaserum controleputjes, uit met gebruikmaking van een speciaal
cobaye. Les valeurs DO et PI sont utilisées pour déterminer si le test
a été exécuté dans les limites acceptables. Les limites supérieures et softwarepakket. De verkregen OD- en PI-waarden worden gebruikt om te
inférieures des sérums-contrôles de cobaye se situent respectivement bepalen of de testresultaten binnen aanvaardbare grenzen liggen. De
entre les valeurs 1,4 et 0,4 de DO. OD-waarden voor de caviaserum controles liggen tussen OD = 1,4
Le titre du point terminal du contrôle positif sur la base d'un PI de (bovengrens) en OD = 0,4 (ondergrens). De eindpunttiter van de
50 % devrait être de 1/240 (entre 1/120 A 1/480). Toute plaque non positieve controle, gebaseerd op 50 % PI, zou 1/240 moeten bedragen
conforme aux critères précités doit être rejetée. Toutefois, si le (tussen 1/120 en 1/480). Elk plaatje dat niet aan bovenstaande
titre du sérum de contrôle positif est supérieur A 1/480 et que les criteria voldoet, moet worden afgewezen. Indien het positieve
échantillons testés sont toujours négatifs, les échantillons réputés controleserum evenwel een titer te zien geeft die groter is dan 1 op
négatifs peuvent être acceptés.
Les puits de sérum de contrôle négatif dédoublés et les puits de 480 en de testmonsters toch negatief zijn, mogen de negatieve
testmonsters worden geaccepteerd.
contrôle A blanc dédoublés devraient présenter des valeurs PI De PI-waarden van het in duplo geteste negatieve controleserum en de
comprises respectivement entre + 25 % et - 25 % et entre + 95 % et + in duplo blanco's moeten liggen tussen + 25 % en - 25 %,
105 %. Le non-respect de ces limites n'a pas pour effet d'invalider respectievelijk tussen + 95 en + 105 %. Indien deze waarden buiten de
les résultats de la plaque, mais il laisse supposer la formation d'une boven-en ondergrenzen liggen, is de test niet als zodanig mislukt maar
couleur de bruit de fond. is er mogelijk sprake van een te hoge achtergrondkleuring.
1.2.2. Le seuil de diagnostic (valeur limite) pour les sérums testés 1.2.2. De diagnostische drempel (afkapwaarde) voor testsera bedraagt
est de 50 % (PI 50 %). Les échantillons donnant des valeurs PI 50 % (PI 50 %). Monsters met een PI-waarde die groter is dan 50 %,
supérieures A 50 % sont considérés comme positifs. Les échantillons worden als positief beschouwd. Monsters met een PI-waarde die lager is
donnant des valeurs PI inférieures A 50 % sont considérés comme dan 50 %, worden als negatief beschouwd.
négatifs. Les échantillons qui présentent des valeurs PI supérieures ou Monsters met duplo's waarvan één PI-waarde boven en één beneden de
inférieures au seuil pour les puits dédoublés sont considérés comme diagnostische drempel ligt, worden als twijfelachtig beschouwd.
douteux. Ces échantillons peuvent être retestés par test ponctuel ou Dergelijke monsters kunnen opnieuw worden getest met de spottest of
par titrage. Les échantillons positifs peuvent également être titrés door titrering. Positieve monsters mogen ook worden getitreerd om een
afin de fournir une indication du degré de positivité. indicatie te geven van de graad van positiviteit.
Analyse ponctuelle Proefopstelling spottest
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
12 12
c + + Cont.
Sérums testés Testsera
1:5 1:5
c- - Cont.
31 31
32 32
33 33
34 34
35 35
36 36
37 37
38 38
39 39
40 40
1:10 1:10
c- - Cont.
31 31
32 32
33 33
34 34
35 35
36 36
37 37
38 38
39 39
40 40
1:20 1:20
A blanc Blank
1:40 A blanc 1:80 cc 1:40 Blank 4 1:80 GP Cont.
1:160 1:160
cc GP Cont.
1:320 1:320
cc GP Cont.
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
1:640 1:640
cc GP cont.
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
C - = contrôle négatif. - Cont. = negatieve controle.
C + = contrôle positif. + Cont. = positieve controle. GP Cont.
CC = contrôle de cobaye. = Guinea Pig Control (caviacontrole).
Titrage du sérum Proefopstelling serumtitrering
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
12 12
c + + Cont.
Sérums testés Testsera
1:5 1:5
c- - Cont.
1:5 1:5
1:5 1:5
1:10 1:10
c- - Cont.
1:10 1:10
1:10 1:10
1:20 1:20
A blanc Blank
1:20 1:20
1:20 1:20
1:40 1:40
A blanc Blank
1:40 1:40
1:40 1:40
1:80 1:80
cc GP Cont.
1:80 1:80
1:80 1:80
1:160 1:160
cc GP Cont.
1:160 1:160
1:160 1:160
1:320 1:320
cc GP Cont.
1:320 1:320
1:320 1:320
1:640 1:640
cc GP Cont.
1:640 1:640
1:640 1:640
C - = contrôle négatif. - Cont. = negatieve controle.
C + = contrôle positif. + Cont. = positieve controle. GP Cont.
CC = contrôle de cobaye. = Guinea Pig Control (caviacontrole).
2. TEST ELISA INDIRECT POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test décrit ci-après est conforme A la description du chapitre 2.1.11 du manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE, quatrième édition, 2000. La protéine recombinante VP7 a été utilisée comme antigène pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre le virus de la peste équine; la méthode est très sensible et très spécifique. Cette protéine présente également l'avantage d'être stable et non infectieuse. 2. INDIRECTE ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST) De hieronder beschreven test is in overeenstemming met de testprocedure die is beschreven in hoofdstuk 2.1.11 van het « Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines » van het OIE, vierde editie, 2000. Recombinant VP7 proteïne is gebruikt als antigeen voor de bepaling van antilichamen tegen AHSV met een hoge gevoeligheid en specificiteit. Andere voordelen zijn dat het stabiel is en niet besmettelijk.
2.1. Description du test 2.1. Testprocedure
2.1.1. Phase solide 2.1.1. Vaste fase
2.1.1.1. Des plaques ELISA sont sensibilisées avec la protéine 2.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met recombinant AHSV-4 VP7, verdund in
recombinante VP7 du VPE de sérotype 4, diluée dans du tampon
carbonate/bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques pendant une nuit carbonaat/bicarbonaatbuffer. Incubeer de plaatjes gedurende één nacht
A 4 °C. bij 4 °C, pH 9,6.
2.1.1.2. Rincer les plaques 5 fois avec de l'eau distillée contenant 2.1.1.2. Was de plaatjes vijfmaal met gedistilleerd water dat 0,01 %
0,01 % (v/v) de Tween-20 (solution de lavage). Secouer doucement les (v/v) Tween 20 (wasoplossing) bevat. Klop de plaatjes zachtjes af op
plaques sur un matériel absorbant pour enlever toute trace de rinçage. absorberend materiaal om resten van het wassen te verwijderen.
2.1.1.3. Saturer les plaques avec une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé 2.1.1.3. Blokkeer de plaatjes met PBS + 5 % (w/v) magere melk
en poudre (lait NestléTM), A raison de 200 µl par puits pendant 1 (mageremelkpoeder van NestléTM), 200 µl per putje, gedurende 1 uur bij
heure A 37 °C. 37 °C.
2.1.1.4. Enlever la solution de saturation et secouer doucement les 2.1.1.4. Verwijder de blockingbuffer en klop de plaatjes zachtjes af
plaques sur un matériel absorbant. op absorberend materiaal.
2.1.2. Echantillons 2.1.2. Testmonsters
2.1.2.1. Les sérums A tester et les sérums positif et négatif de 2.1.2.1. De te testen serummonsters en de positieve en negatieve
contrôle sont dilués au 1/25 dans une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé controlesera worden verdund in een verhouding 1 op 25 in PBS + 5 %
+ 0,05 % (v/v) de Tween-20; ils sont ensuite déposés A raison de 100 (w/v) magere melk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 µl per putje. Incubeer
µl par puits. Incuber pendant 1 heure A 37 °C. gedurende 1 uur bij 37 °C.
Pour le titrage, réaliser des séries de dilution de 2 en 2 A partir du Voor titrering wordt een tweevoudige verdunningsreeks aangelegd te
1/25e (100 µl/puits), en utilisant une colonne de la plaque par sérum; beginnen bij 1 op 25 (100 µl/ putje), één serum per kolom, en wordt
réaliser la même chose avec les contrôles positif et négatif. Incuber hetzelfde gedaan met de positieve en de negatieve controles. Incubeer
pendant 1 heure A 37 °C. gedurende 1 uur bij 37 °C.
2.1.2.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2. 2.1.2.2. Was de plaatjes als omschreven onder 2.1.1.2.
2.1.3. Conjugué 2.1.3. Conjugaat
2.1.3.1. Déposer 100 µl/puits des anticorps anti-cheval conjugués A la 2.1.3.1. Pipetteer in elk putje 100 µl met HRP geconjugeerd anti-paard
peroxydase de raifort; ces anticorps sont dilués dans une SSTP + 5 % gamma-globuline, verdund in PBS + 5 % melk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
de lait écrémé + 0,05 % de Tween-20 de pH 7,2. Incuber pendant 1 heure A 37 °C. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
2.1.3.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2. 2.1.3.2. Was de plaatjes als omschreven onder 2.1.1.2.
2.1.4. Chromogène/substrat 2.1.4. Chromogeen/Substraat
2.1.4.1. Ajouter 200 µl /puits de la solution de chromogène/substrat 2.1.4.1. Pipetteer in elk putje 200 µl chromogeen/substraatoplossing
[10 ml de 80,6 mM de DMAB (diméthylaminobenzaldéhyde) + 10 ml de 1,56 [10 ml van 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml van 1,56
mM de MBTH (3-méthyl-2-benzothiazoline d'hydrochlorure d'hydrazone) + 5 µl de H2O2]. mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolin hydrazon hydro-chloride) + 5 µl H2O2].
Kleurontwikkeling wordt gestopt door toevoeging van 50 µl 3N H2SO4 na
Bloquer après environ 5 A 10 minutes (avant que le contrôle négatif ne 5 A 10 minuten (voordat de negatieve controle begint te kleuren).
commence A se colorer) la réaction colorimétrique en ajoutant 50 µl de H2S04 3N.
D'autres chromogènes tels que le ABTS Andere chromogenen, bijv. ABTS
(2,2'-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique), le TMB (2.2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB
(tétraméthyle de benzidine) ou l'OPD (ortho-phényldiamine) peuvent (tetra-methyl benzidine), of OPD (ortho-phenyldiamine) mogen ook
aussi être utilisés. worden gebruikt.
2.1.4.2. Lire la plaque A 600 nm (ou 620 nm). 2.1.4.2. Lees de plaatjes af bij een golflengte van 600 nm (of 620 nm).
2.2. Interprétation des résultats 2.2. Interpretatie van de resultaten
2.2.1. Calculer la valeur du seuil par addition de 0,6 A la valeur du 2.2.1. Bereken de afkapwaarde door 0,6 toe te voegen aan de waarde van
contrôle négatif (0,6 est 1'écart type calculé A partir d'un groupe de de negatieve controle (0,6 is de afgeleide standaarddeviatie bij een
30 sérums négatifs). 2.2.2. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance inférieure au seuil sont considérés comme négatifs. 2.2.3. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance plus grande que le seuil + 0,15 sont considérés comme positifs. 2.2.4. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance intermédiaire sont douteux et une deuxième technique doit être employée pour confirmer le résultat. 3. TEST ELISA BLOQUANT VISANT A DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test ELISA bloquant est destiné A déceler la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce sensible. La VP7 constitue la protéine antigénique principale du VPE; elle est présente dans les 9 sérotypes. Du fait que groep van 30 negatieve sera). 2.2.2. Testmonsters met absorptiewaarden beneden de afkapwaarde worden als negatief beschouwd. 2.2.3. Testmonsters met absorptiewaarden boven de afkapwaarde +0,15 worden als positief beschouwd. 2.2.4. Testmonsters met een tussenliggende absorptiewaarde zijn twijfelachtig en in dat geval moet een tweede methode worden toegepast om het resultaat te bevestigen. 3. BLOKKERINGS-ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST) De blokkerings-ELISA is gericht op het aantonen van specifieke antilichamen tegen AHSV in sera van elke gevoelige diersoort. VP7 is het belangrijkste antigene virusproteïne van AHSV en komt voor binnen
l'anticorps monoclonal est également dirigé contre la protéine VP7, le de negen serotypen. Aangezien het monoklonale antilichaam (Mab) ook
test sera très sensible et très spécifique. En outre, l'antigène gericht is tegen het VP7, heeft de test een zeer grote gevoeligheid en
recombinant VP7 est totalement inoffensif et très sûr. specificiteit. Voorts is recombinant VP7 antigeen totaal onschadelijk
en is bijgevolg een zeer hoge veiligheidsgraad gegarandeerd.
Le principe du test est la diminution de la réaction entre la protéine De test is gebaseerd op het onderbreken van de reactie tussen het
recombinante VP7, en tant qu'antigène lié A la plaque ELISA, et recombinant VP7, d.i. het aan het ELISA-plaatje gebonden antigeen, en
l'anticorps monoclonal conjugué, spécifique de la protéine VP7. Les het geconjugeerde Mab dat specifiek is voor VP7. Antilichamen in het
anticorps dans les sérums A tester bloqueront la réaction entre testserum blokkeren de reactie tussen het antigeen en het Mab, wat
l'antigène et l'anticorps monoclonal, ce qui entraînera une réduction de la couleur. resulteert in vermindering van de kleurontwikkeling.
Le test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire communautaire De hieronder beschreven test wordt uitgevoerd in het communautair
de référence pour la peste équine de Algete, Espagne. referentielaboratorium voor paardenpest in Algete, Spanje.
3.1. Description du test 3.1. Testprocedure
3.1.1. Plaques ELISA 3.1.1. ELISA-plaatjes
3.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de 1'antigène du VPE de 3.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met recombinant AHSV-4 VP7,
sérotype 4 avec la protéine recombinante VP7, diluée dans un tampon voorverdund in carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Incubeer de
carbonate/bicarbonate de pH 9,6, et incuber pendant une nuit A 4 °C. plaatjes gedurende één nacht bij 4 °C.
3.1.1.2. Laver les plaques 5 fois avec une solution saline tamponnée
au phosphate (SSTP) contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20. 3.1.1.2. Was de plaatjes vijfmaal met PBST (PBS waaraan 0,05 % (v/v)
3.1.1.3. Stabiliser la plaque par traitement A 1'aide d'une solution Tween 20 is toegevoegd). 3.1.1.3. Stabiliseer de plaatjes door behandeling met een
de stabilisation (pour permettre un stockage A long terme A 4 °C sans stabilisatieoplossing (met het oog op langdurige opslag bij 4 °C
perte d'activité) et sécher au buvard. zonder verlies van werkzaamheid) en sla de plaatjes droog op
absorberend materiaal.
3.1.2. Echantillons et contrôles 3.1.2. Testmonsters en controles
3.1.2.1. Criblage: Diluer les sérums A tester et les contrôles dans la 3.1.2.1. Voor screening : Verdun de testsera en de controles in een
proportion de 1 A 10 directement sur la plaque dans la SSTP afin verhouding 1 op 10, rechtstreeks op het plaatje in PBST, tot een
d'obtenir un volume final de 100 µl par puits. Incuber pendant 1 heure uiteindelijk volume van 100 µl per putje. Incubeer gedurende 1 uur bij
A 37 °C. 37 °C.
3.1.2.2. Titrage: Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de sérums 3.1.2.2. Voor titrering : Leg een tweevoudige verdunningsreeks aan van
A tester et de contrôles positifs (100 µl par puits) de 1/10 A 1/1280 de testsera en de positieve controles (100 µl per putje) verdeeld over
A déposer dans huit puits. Le contrôle négatif est testé A une 8 putjes, gaande van 1 op 10 tot 1 op 1 280. Een negatieve controle
dilution de 1/10. wordt getest in de verdunning 1 op 10.
3.1.3. Conjugué 3.1.3. Conjugaat
Ajouter 50 µl d'anticorps monoclonal préalablement dilué (anticorps Pipetteer 50 µl voorverdund, aan HRP (horseradish-peroxidase)
monoclonal conjugué avec la peroxydase du raifort) dans chaque puits geconjugeerd Mab (voor VP7 specifieke monoklonale antilichamen) in elk
et mélanger doucement afin de garantir l'homogénéité. Incuber pendant putje en meng zachtjes om homogeniteit te garanderen. Incubeer
30 minutes A 37 °C. gedurende 30 minuten bij 37 °C.
3.1.4. Laver les plaques 5 fois A l'aide de SSTP et sécher au buvard 3.1.4. Was de plaatjes vijfmaal met PBST en sla droog als hierboven
comme décrit ci-dessus. omschreven.
3.1.5. Chromogène/substrat 3.1.5. Chromogeen/Substraat
Ajouter 100 µl par puits de la solution suivante de chromogène/substrat: 1 ml de ABTS Pipetteer 100 µl chromogeen/substraatoplossing in elk putje [(1 ml
(2,2-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique]) A 5 mg/ml ABTS (2.2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml
+ 9 ml de tampon de substrat (0,1M de tampon de phosphate-citrate de + 9 ml substraatbuffer (0,1M fosfaat-citraatbuffer met pH 4 die 0,03 %
pH 4 contenant 0,03 % de H2O2), puis incuber pendant 10 minutes A H2O2 bevat)] en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
température ambiante. Le développement de la couleur est arrêté par Stop de kleurontwikkeling door toevoeging van 2 % (w/v) SDS
l'addition de 100 µl par puits de SDS (sulfate de sodium dodécyl) A 2 % (m/v). (natriumdodecylsulfaat) (100 µl per putje).
3.1.6. Lecture 3.1.6. Aflezen
Lire A 405 nm dans un lecteur ELISA. Lees af bij een golflengte van 405 nm in een ELISA-leesapparaat.
3.2. Interprétation des résultats 3.2. Interpretatie van de resultaten
3.2.1. Validité du test 3.2.1. Validering van de test
Le test est valable lorsque la densité optique (DO) du contrôle De test is geldig wanneer de optische densiteit (OD) van de negatieve
négatif (CN) est supérieure A 1,0 et que la DO du contrôle positif controle (NC) hoger is dan 1,0 en de OD van de positieve controle (PC)
(CP) est inférieure A 0,2. lager is dan 0,2.
3.2.2. Calcul des limites 3.2.2. Berekening van de afkapwaarde
Limite positive = CN - ((CN - CP) x 0,3) Positieve afkapwaarde = NC - ((NC - PC) x 0,3)
Limite négative = CN - ((CN - CP) x 0,2) CN est la DO du contrôle négatif et CP est la DO du contrôle positif. 3.2.3. Interprétation des résultats Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO inférieures A la limite positive doivent être considérés comme positifs. Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO supérieures A la limite positive doivent être considérés comme négatifs. Les échantillons présentant des DO comprises entre ces deux valeurs doivent être considérés comme douteux et des échantillons doivent être Negatieve afkapwaarde = NC - ((NC - PC) x 0,2) NC is de OD van de negatieve controle en PC is de OD van de positieve controle. 3.2.3. Interpretatie van de resultaten Monsters met een OD beneden de positieve afkapwaarde worden als positief voor antilichamen tegen AHSV aangemerkt. Monsters met een OD boven de negatieve afkapwaarde worden als negatief voor antilichamen tegen AHSV aangemerkt. Monsters met een OD tussen deze beide waarden worden als twijfelachtig
prélevés de nouveau sur les animaux après 2 A 3 semaines. » aangemerkt en de betrokken dieren moeten 2 A 3 weken later opnieuw
Vu pour être annexé A notre arrêté du 28 juin 2009 modifiant l'arrêté worden bemonsterd. Gezien om gevoegd te worden bij ons besluit van 28 juni 2009 tot
royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine. wijziging van het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende
La Ministre de la Santé publique, de bestrijding van paardenpest.
De Minister van Volksgezondheid,
Mme L. ONKELINX Mevr. L. ONKELINX
La Ministre de l'Agriculture, De Minister van Landbouw,
Mme S. LARUELLE Mevr. S. LARUELLE
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