28 JUIN 2009. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine

ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et A venir, Salut.

Vu la loi du 24 mars 1987 relative A la santé des animaux, l'article 9, 5°, modifié par la loi du 28 mars 2003;

Vu l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine;

Considérant la Directive 90/426/CEE du Conseil du 26 juin 1990 relative aux conditions de police sanitaire régissant les mouvements d'équidés en provenance des pays tiers, annexe D;

Considérant la Décision 2002/160/CE de la Commission du 21 février 2002 modifiant l'annexe D de la Directive 90/426/CEE du Conseil concernant les tests de diagnostic de la peste équine;

Vu l'avis de l'Inspecteur des Finances, donné le 20 août 2008;

Vu l'avis 45.598/3 du Conseil d'Etat, donné le 3 mars 2009, en application de l'article 84, § 1er, 1°, des lois sur le Conseil d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973;

Sur la proposition de la Ministre de la Santé publique et de la Ministre de l'Agriculture, Nous avons arrêté et arrêtons :

Article 1er.Dans l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine, l'annexe 1 est remplacée par l'annexe jointe au présent arrêté.

Art. 2.La Ministre qui a la Santé publique dans ses attributions et la Ministre qui a l'Agriculture dans ses attributions sont chargées, chacune en ce qui la concerne, de l'exécution du présent arrêté.

Donné A Bruxelles, le 28 juin 2009.

ALBERT Par le Roi : La Ministre de la Santé publique, Mme L. ONKELINX La Ministre de l'Agriculture, Mme S. LARUELLE

Annexe A l'arrêté royal du 28 juin 2009 modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine DIAGNOSTIC DE LA PESTE EQUINE Les réactifs pour les techniques immuno-enzymatiques (ELISA) décrites ci-dessous peuvent être obtenus auprès du laboratoire communautaire de référence ou des laboratoires de référence de l'OIE pour la peste équine. 1. TEST ELISA DE COMPETITION POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test ELISA de compétition est utilisé pour détecter la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce d'équidés.L'antisérum de cobaye contre le VPE, ci-après dénommé "antisérum de cobaye", est un antisérum A large spectre, polyclonal et immun; il est spécifique du sérogroupe PE et permet de détecter tous les sérotypes connus du virus de cette maladie.

Le principe du test est une diminution de la réaction entre l'antigène du VPE et un antisérum de cobaye par un échantillon de sérum A tester.

Les anticorps du VPE dans l'échantillon de sérum A tester seront en compétition avec ceux de l'antisérum de cobaye, ce qui entraînera une réduction de la couleur attendue (après ajout d'un anticorps anticobaye marqué par un enzyme et du substrat). Les sérums peuvent être testés A une seule dilution de 1/5 (méthode du test ponctuel) ou être titrés (méthode de titrage du sérum), pour donner les points terminaux de dilution. Des valeurs d'inhibition supérieures A 50 % peuvent être considérées comme positives.

Le protocole du test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire régional de référence pour la peste équine de Pirbright, Royaume-Uni. 1.1. Description du test 1.1.1. Préparation des plaques 1.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de l'antigène du VPE extrait de cultures de cellules infectées, dilué dans un tampon carbonate-bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques ELISA pendant une nuit A 4 °C. 1.1.1.2. Laver les plaques trois fois par rinçage et vider les puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (SSTP) de pH 7,2-7,4, puis sécher au buvard. 1.1.2. Puits de contrôle 1.1.2.1. Titrer les sérums de contrôle positifs dans une série de dilutions de 2 en 2, de 1/5 A 1/640, dans la colonne 1, dans un tampon de blocage SSTP contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20, 5,0 % (m/v) de lait écrémé en poudre (Cadbury's MarvelTM) et 1 % (v/v) de sérum bovin adulte, afin d'obtenir un volume final de 50 µl par puits. 1.1.2.2. Ajouter 50 µl de sérum de contrôle négatif A une dilution de 1/5 (10 µl de sérum + 40 µl de tampon de blocage) aux puits A et B de la colonne 2. 1.1.2.3. Ajouter 100 µl par puits de tampon de blocage aux puits C et D de la colonne 2 (CONTROLE A BLANC). 1.1.2.4. Ajouter 50 µl de tampon de blocage aux puits E, F, G et H de la colonne 2 (contrôle sérum de cobaye). 1.1.3. Méthode du test ponctuel 1.1.3.1. Ajouter au tampon de blocage une dilution A 1/5 de chaque sérum A tester afin de doubler les puits des colonnes 3 A 12 (sérums de 10 µl + 40 µl de tampon de blocage). ou 1.1.4. Méthode de titrage du sérum 1.1.4.1. Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de chaque échantillon A tester (de 1/5 A 1/640) dans un tampon de blocage dans huit puits de chacune des colonnes 3 A 12. ensuite 1.1.5. Ajouter 50 µl d'antisérum de cobaye, préalablement dilué dans le tampon de blocage, A l'ensemble des puits, excepté les puits DE CONTROLE A BLANC de la plaque ELISA (tous les puits contiennent A présent un volume final de 100 µl). 1.1.5.1. Incuber pendant 1 heure A 37 °C dans un agitateur rotatif. 1.1.5.2. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment. 1.1.5.3. Ajouter A chaque puits 50 µl de sérum de lapin anticobaye conjugué A de la peroxydase de raifort, préalablement dilué dans un tampon de blocage. 1.1.5.4. Incuber pendant 1 heure A 37 °C dans un agitateur rotatif. 1.1.5.4. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment. 1.1.6. Chromogène Préparer la solution chromogène OPD (OPD = orthophényldiamine) selon les instructions du fabricant (0,4 mg/ml dans de l'eau distillée stérile) juste avant de l'utiliser. Ajouter un substrat (peroxyde d'hydrogène = H2O2), afin d'obtenir une concentration finale de 0,05 % (v/v) (1/2000 d'une solution A 30 % de H2O2). Ajouter 50 µl de la solution OPD A chaque puits et laisser les plaques sur la paillasse pendant 10 minutes A température ambiante. Stopper la réaction en ajoutant 50 µl par puits d'acide sulfurique 1M (H2SO4). 1.1.7. Lecture Lecture par spectrophotométrie A 492 nm. 1.2. Expression des résultats 1.2.1. A l'aide éventuelle d'un logiciel, déterminer les valeurs de densité optique (DO) et le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums A tester et des sérums de contrôle, sur la base de la valeur moyenne enregistrée dans les quatre puits contenant les sérums-contrôles de cobaye. Les valeurs DO et PI sont utilisées pour déterminer si le test a été exécuté dans les limites acceptables. Les limites supérieures et inférieures des sérums-contrôles de cobaye se situent respectivement entre les valeurs 1,4 et 0,4 de DO. Le titre du point terminal du contrôle positif sur la base d'un PI de 50 % devrait être de 1/240 (entre 1/120 A 1/480). Toute plaque non conforme aux critères précités doit être rejetée. Toutefois, si le titre du sérum de contrôle positif est supérieur A 1/480 et que les échantillons testés sont toujours négatifs, les échantillons réputés négatifs peuvent être acceptés.

Les puits de sérum de contrôle négatif dédoublés et les puits de contrôle A blanc dédoublés devraient présenter des valeurs PI comprises respectivement entre + 25 % et - 25 % et entre + 95 % et + 105 %. Le non-respect de ces limites n'a pas pour effet d'invalider les résultats de la plaque, mais il laisse supposer la formation d'une couleur de bruit de fond. 1.2.2. Le seuil de diagnostic (valeur limite) pour les sérums testés est de 50 % (PI 50 %). Les échantillons donnant des valeurs PI supérieures A 50 % sont considérés comme positifs. Les échantillons donnant des valeurs PI inférieures A 50 % sont considérés comme négatifs.

Les échantillons qui présentent des valeurs PI supérieures ou inférieures au seuil pour les puits dédoublés sont considérés comme douteux. Ces échantillons peuvent être retestés par test ponctuel ou par titrage. Les échantillons positifs peuvent également être titrés afin de fournir une indication du degré de positivité.

Analyse ponctuelle

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

c +

Sérums testés

1:5

c-

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

1:10

c-

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

1:20

A blanc

1:40

A blanc

1:80

cc

1:160

cc

1:320

cc

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1:640

cc

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

C - = contrôle négatif.

C + = contrôle positif.

CC = contrôle de cobaye.

Titrage du sérum

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

c +

Sérums testés

1:5

c-

1:5

1:5

1:10

c-

1:10

1:10

1:20

A blanc

1:20

1:20

1:40

A blanc

1:40

1:40

1:80

cc

1:80

1:80

1:160

cc

1:160

1:160

1:320

cc

1:320

1:320

1:640

cc

1:640

1:640

C - = contrôle négatif.

C + = contrôle positif.

CC = contrôle de cobaye. 2. TEST ELISA INDIRECT POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test décrit ci-après est conforme A la description du chapitre 2.1.11 du manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE, quatrième édition, 2000.

La protéine recombinante VP7 a été utilisée comme antigène pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre le virus de la peste équine; la méthode est très sensible et très spécifique. Cette protéine présente également l'avantage d'être stable et non infectieuse. 2.1. Description du test 2.1.1. Phase solide 2.1.1.1. Des plaques ELISA sont sensibilisées avec la protéine recombinante VP7 du VPE de sérotype 4, diluée dans du tampon carbonate/bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques pendant une nuit A 4 °C. 2.1.1.2. Rincer les plaques 5 fois avec de l'eau distillée contenant 0,01 % (v/v) de Tween-20 (solution de lavage). Secouer doucement les plaques sur un matériel absorbant pour enlever toute trace de rinçage. 2.1.1.3. Saturer les plaques avec une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé en poudre (lait NestléTM), A raison de 200 µl par puits pendant 1 heure A 37 °C. 2.1.1.4. Enlever la solution de saturation et secouer doucement les plaques sur un matériel absorbant. 2.1.2. Echantillons 2.1.2.1. Les sérums A tester et les sérums positif et négatif de contrôle sont dilués au 1/25 dans une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé + 0,05 % (v/v) de Tween-20; ils sont ensuite déposés A raison de 100 µl par puits. Incuber pendant 1 heure A 37 °C. Pour le titrage, réaliser des séries de dilution de 2 en 2 A partir du 1/25e (100 µl/puits), en utilisant une colonne de la plaque par sérum; réaliser la même chose avec les contrôles positif et négatif. Incuber pendant 1 heure A 37 °C. 2.1.2.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2. 2.1.3. Conjugué 2.1.3.1. Déposer 100 µl/puits des anticorps anti-cheval conjugués A la peroxydase de raifort; ces anticorps sont dilués dans une SSTP + 5 % de lait écrémé + 0,05 % de Tween-20 de pH 7,2. Incuber pendant 1 heure A 37 °C. 2.1.3.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2. 2.1.4. Chromogène/substrat 2.1.4.1. Ajouter 200 µl /puits de la solution de chromogène/substrat [10 ml de 80,6 mM de DMAB (diméthylaminobenzaldéhyde) + 10 ml de 1,56 mM de MBTH (3-méthyl-2-benzothiazoline d'hydrochlorure d'hydrazone) + 5 µl de H2O2].

Bloquer après environ 5 A 10 minutes (avant que le contrôle négatif ne commence A se colorer) la réaction colorimétrique en ajoutant 50 µl de H2S04 3N. D'autres chromogènes tels que le ABTS (2,2'-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique), le TMB (tétraméthyle de benzidine) ou l'OPD (ortho-phényldiamine) peuvent aussi être utilisés. 2.1.4.2. Lire la plaque A 600 nm (ou 620 nm). 2.2. Interprétation des résultats 2.2.1. Calculer la valeur du seuil par addition de 0,6 A la valeur du contrôle négatif (0,6 est 1'écart type calculé A partir d'un groupe de 30 sérums négatifs). 2.2.2. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance inférieure au seuil sont considérés comme négatifs. 2.2.3. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance plus grande que le seuil + 0,15 sont considérés comme positifs. 2.2.4. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance intermédiaire sont douteux et une deuxième technique doit être employée pour confirmer le résultat. 3. TEST ELISA BLOQUANT VISANT A DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test ELISA bloquant est destiné A déceler la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce sensible.La VP7 constitue la protéine antigénique principale du VPE; elle est présente dans les 9 sérotypes. Du fait que l'anticorps monoclonal est également dirigé contre la protéine VP7, le test sera très sensible et très spécifique. En outre, l'antigène recombinant VP7 est totalement inoffensif et très sûr.

Le principe du test est la diminution de la réaction entre la protéine recombinante VP7, en tant qu'antigène lié A la plaque ELISA, et l'anticorps monoclonal conjugué, spécifique de la protéine VP7. Les anticorps dans les sérums A tester bloqueront la réaction entre l'antigène et l'anticorps monoclonal, ce qui entraînera une réduction de la couleur.

Le test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire communautaire de référence pour la peste équine de Algete, Espagne. 3.1. Description du test 3.1.1. Plaques ELISA 3.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de 1'antigène du VPE de sérotype 4 avec la protéine recombinante VP7, diluée dans un tampon carbonate/bicarbonate de pH 9,6, et incuber pendant une nuit A 4 °C. 3.1.1.2. Laver les plaques 5 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (SSTP) contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20. 3.1.1.3. Stabiliser la plaque par traitement A 1'aide d'une solution de stabilisation (pour permettre un stockage A long terme A 4 °C sans perte d'activité) et sécher au buvard. 3.1.2. Echantillons et contrôles 3.1.2.1. Criblage: Diluer les sérums A tester et les contrôles dans la proportion de 1 A 10 directement sur la plaque dans la SSTP afin d'obtenir un volume final de 100 µl par puits. Incuber pendant 1 heure A 37 °C. 3.1.2.2. Titrage: Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de sérums A tester et de contrôles positifs (100 µl par puits) de 1/10 A 1/1280 A déposer dans huit puits. Le contrôle négatif est testé A une dilution de 1/10. 3.1.3. Conjugué Ajouter 50 µl d'anticorps monoclonal préalablement dilué (anticorps monoclonal conjugué avec la peroxydase du raifort) dans chaque puits et mélanger doucement afin de garantir l'homogénéité. Incuber pendant 30 minutes A 37 °C. 3.1.4. Laver les plaques 5 fois A l'aide de SSTP et sécher au buvard comme décrit ci-dessus. 3.1.5. Chromogène/substrat Ajouter 100 µl par puits de la solution suivante de chromogène/substrat: 1 ml de ABTS (2,2-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique]) A 5 mg/ml + 9 ml de tampon de substrat (0,1M de tampon de phosphate-citrate de pH 4 contenant 0,03 % de H2O2), puis incuber pendant 10 minutes A température ambiante. Le développement de la couleur est arrêté par l'addition de 100 µl par puits de SDS (sulfate de sodium dodécyl) A 2 % (m/v). 3.1.6. Lecture Lire A 405 nm dans un lecteur ELISA. 3.2. Interprétation des résultats 3.2.1. Validité du test Le test est valable lorsque la densité optique (DO) du contrôle négatif (CN) est supérieure A 1,0 et que la DO du contrôle positif (CP) est inférieure A 0,2. 3.2.2. Calcul des limites Limite positive = CN - ((CN - CP) x 0,3) Limite négative = CN - ((CN - CP) x 0,2) CN est la DO du contrôle négatif et CP est la DO du contrôle positif. 3.2.3. Interprétation des résultats Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO inférieures A la limite positive doivent être considérés comme positifs.

Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO supérieures A la limite positive doivent être considérés comme négatifs.

Les échantillons présentant des DO comprises entre ces deux valeurs doivent être considérés comme douteux et des échantillons doivent être prélevés de nouveau sur les animaux après 2 A 3 semaines. » Vu pour être annexé A notre arrêté du 28 juin 2009 modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine.

La Ministre de la Santé publique, Mme L. ONKELINX La Ministre de l'Agriculture, Mme S. LARUELLE