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Meertalige weergave van Koninklijk Besluit van 28/06/2009
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Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de bestrijding van paardenpest Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine
FEDERALE OVERHEIDSDIENST VOLKSGEZONDHEID, VEILIGHEID VAN DE VOEDSELKETEN EN LEEFMILIEU 28 JUNI 2009. - Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de bestrijding van paardenpest ALBERT II, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet. Gelet op de dierengezondheidswet van 24 maart 1987, artikel 9, 5°, SERVICE PUBLIC FEDERAL SANTE PUBLIQUE, SECURITE DE LA CHAINE ALIMENTAIRE ET ENVIRONNEMENT 28 JUIN 2009. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et A venir, Salut. Vu la loi du 24 mars 1987 relative A la santé des animaux, l'article
gewijzigd bij de wet van 28 maart 2003; 9, 5°, modifié par la loi du 28 mars 2003;
Gelet op het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de Vu l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la
bestrijding van paardenpest; peste équine;
Overwegende de Richtlijn 90/426/EEG van de Raad van 26 juni 1990 met Considérant la Directive 90/426/CEE du Conseil du 26 juin 1990
betrekking tot vaststelling van veterinairrechtelijke voorschriften
voor het verkeer van paardachtigen en de invoer van paardachtigen uit relative aux conditions de police sanitaire régissant les mouvements
derde landen, bijlage D; d'équidés en provenance des pays tiers, annexe D;
Overwegende de Beschikking 2002/160/EG van de Commissie van 21 Considérant la Décision 2002/160/CE de la Commission du 21 février
februari 2002 tot wijziging van bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG van 2002 modifiant l'annexe D de la Directive 90/426/CEE du Conseil
de Raad met betrekking tot de diagnostische tests voor paardenpest; concernant les tests de diagnostic de la peste équine;
Gelet op het advies van de Inspecteur van Financiën, gegeven op 20 Vu l'avis de l'Inspecteur des Finances, donné le 20 août 2008;
augustus 2008;
Gelet op advies 45.598/3 van de Raad van State, gegeven op 3 maart Vu l'avis 45.598/3 du Conseil d'Etat, donné le 3 mars 2009, en
2009, met toepassing van artikel 84, § 1, eerste lid, van de wetten op application de l'article 84, § 1er, 1°, des lois sur le Conseil
de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973; d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973;
Op de voordracht van de Minister van Volksgezondheid en de Minister Sur la proposition de la Ministre de la Santé publique et de la
van Landbouw, Ministre de l'Agriculture,
Hebben Wij besloten en besluiten Wij : Nous avons arrêté et arrêtons :

Artikel 1.In het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende

Article 1er.Dans l'arrêté royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte
de bestrijding van paardenpest wordt de bijlage 1 vervangen door de contre la peste équine, l'annexe 1 est remplacée par l'annexe jointe
bijlage gevoegd bij dit besluit. au présent arrêté.

Art. 2.De Minister bevoegd voor Volksgezondheid en de Minister

Art. 2.La Ministre qui a la Santé publique dans ses attributions et
bevoegd voor Landbouw zijn, ieder wat hem betreft, belast met de la Ministre qui a l'Agriculture dans ses attributions sont chargées,
uitvoering van dit besluit. chacune en ce qui la concerne, de l'exécution du présent arrêté.
Gegeven te Brussel, 28 juni 2009. Donné A Bruxelles, le 28 juin 2009.
ALBERT ALBERT
Van Koningswege : Par le Roi :
De Minister van Volksgezondheid, La Ministre de la Santé publique,
Mevr. L. ONKELINX Mme L. ONKELINX
De Minister van Landbouw, La Ministre de l'Agriculture,
Mevr. S. LARUELLE Mme S. LARUELLE
Bijlage bij het koninklijk besluit van 28 juni 2009 tot wijziging van Annexe A l'arrêté royal du 28 juin 2009 modifiant l'arrêté royal du 26
het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende de bestrijding van paardepest DIAGNOSE VAN PAARDENPEST Reagentia voor de hieronder beschreven enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kunnen worden bekomen bij het communautaire referentielaboratorium of de referentielaboratoria van het OIE voor paardenpest. 1. COMPETITIE-ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST) De competitie-ELISA wordt gebruikt voor het aantonen van specifieke antilichamen tegen AHSV in sera van paardachtigen. Het breedspectrum, polyklonaal, anti-AHSV caviaserum is serogroepspecifiek en is geschikt voor het aantonen van antilichamen gericht tegen alle bekende serotypes van het paardenpestvirus. De test is gebaseerd op het onderbreken van de reactie tussen het AHSV-antigeen en een anti-AHSV caviaserum door AHSV-antilichamen in een testserummonster. AHSV-antilichamen in het testserummonster gaan competitie aan met de AHSV-antilichamen in het caviaserum, wat resulteert in vermindering van de kleurontwikkeling (na toevoeging van met een enzyme gelabelled anticavia-antilichaam en substraat). De sera kunnen worden getest bij een enkele verdunning van 1 op 5 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine DIAGNOSTIC DE LA PESTE EQUINE Les réactifs pour les techniques immuno-enzymatiques (ELISA) décrites ci-dessous peuvent être obtenus auprès du laboratoire communautaire de référence ou des laboratoires de référence de l'OIE pour la peste équine. 1. TEST ELISA DE COMPETITION POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test ELISA de compétition est utilisé pour détecter la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce d'équidés. L'antisérum de cobaye contre le VPE, ci-après dénommé "antisérum de cobaye", est un antisérum A large spectre, polyclonal et immun; il est spécifique du sérogroupe PE et permet de détecter tous les sérotypes connus du virus de cette maladie. Le principe du test est une diminution de la réaction entre l'antigène du VPE et un antisérum de cobaye par un échantillon de sérum A tester. Les anticorps du VPE dans l'échantillon de sérum A tester seront en compétition avec ceux de l'antisérum de cobaye, ce qui entraînera une réduction de la couleur attendue (après ajout d'un anticorps anticobaye marqué par un enzyme et du substrat). Les sérums peuvent être testés A une seule dilution de 1/5 (méthode du test ponctuel) ou
(spottestmethode) of kunnen worden getitreerd voor het verkrijgen van être titrés (méthode de titrage du sérum), pour donner les points
verdunningseindpunten. Inhibitiewaarden van meer dan 50 % kunnen als terminaux de dilution. Des valeurs d'inhibition supérieures A 50 %
positief worden beschouwd. peuvent être considérées comme positives.
Het hieronder beschreven testprotocol wordt gebruikt in het regionaal Le protocole du test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire
referentielaboratorium voor paardenpest in Pirbright, Verenigd Koninkrijk. régional de référence pour la peste équine de Pirbright, Royaume-Uni.
1.1. Testprocedure 1.1. Description du test
1.1.1. Voorbereiding van de plaatjes 1.1.1. Préparation des plaques
1.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met AHSV-antigeen dat is geëxtraheerd 1.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de l'antigène du VPE extrait de
uit geïnfecteerde celculturen en verdund in cultures de cellules infectées, dilué dans un tampon
carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Incubeer de ELISA-plaatjes bij 4 °C gedurende één nacht. carbonate-bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques ELISA pendant une nuit A 4 °C.
1.1.1.2. Was de plaatjes driemaal door de putjes te vullen met PBS (pH 1.1.1.2. Laver les plaques trois fois par rinçage et vider les puits
7,2-7,4) en vervolgens weer leeg te slaan, en sla de plaatjes droog op avec une solution saline tamponnée au phosphate (SSTP) de pH 7,2-7,4,
absorberend papier. puis sécher au buvard.
1.1.2. Controleputjes 1.1.2. Puits de contrôle
1.1.2.1. Titreer de positieve controlesera in een tweevoudige 1.1.2.1. Titrer les sérums de contrôle positifs dans une série de
verdunningsreeks, 1 op 5 tot 1 op 640, in kolom 1 in blockingbuffer dilutions de 2 en 2, de 1/5 A 1/640, dans la colonne 1, dans un tampon
(PBS met 0,05 % (v/v) Tween-20, 5 % (w/v) mageremelkpoeder (Cadbury's de blocage SSTP contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20, 5,0 % (m/v) de
MarvelTM) en 1 % (v/v) serum van een volwassen rund) tot een lait écrémé en poudre (Cadbury's MarvelTM) et 1 % (v/v) de sérum bovin
eindvolume van 50 µl per putje. adulte, afin d'obtenir un volume final de 50 µl par puits.
1.1.2.2. Pipetteer 50 µl van het negatieve controleserum in een 1.1.2.2. Ajouter 50 µl de sérum de contrôle négatif A une dilution de
verdunning 1 op 5 (10 µl serum + 40 µl blockingbuffer) in de putjes A 1/5 (10 µl de sérum + 40 µl de tampon de blocage) aux puits A et B de
en B van kolom 2. la colonne 2.
1.1.2.3. Pipetteer 100 µl blockingbuffer in de putjes C en D van kolom 1.1.2.3. Ajouter 100 µl par puits de tampon de blocage aux puits C et
2 (BLANCO). D de la colonne 2 (CONTROLE A BLANC).
1.1.2.4. Pipetteer 50 µl blockingbuffer in de putjes E, F, G en H van 1.1.2.4. Ajouter 50 µl de tampon de blocage aux puits E, F, G et H de
kolom 2 (caviaserum controle). la colonne 2 (contrôle sérum de cobaye).
1.1.3. Spottestmethode 1.1.3. Méthode du test ponctuel
1.1.3.1. Pipetteer een verdunning van elk testserum in blockingbuffer 1.1.3.1. Ajouter au tampon de blocage une dilution A 1/5 de chaque
(verhouding 1 op 5) in duplo (twee putjes/monster) van de kolommen 3 sérum A tester afin de doubler les puits des colonnes 3 A 12 (sérums
tot en met 12 (10 µl serum + 40 µl blockingbuffer). de 10 µl + 40 µl de tampon de blocage).
of ou
1.1.4. Serumtitreringsmethode 1.1.4. Méthode de titrage du sérum
1.1.4.1. Bereid een tweevoudige verdunningsreeks van elk testserum (1 1.1.4.1. Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de chaque
op 5 tot 1 op 640) in blockingbuffer en pipetteer deze in 8 putjes van échantillon A tester (de 1/5 A 1/640) dans un tampon de blocage dans
een kolom (een verdunningsreeks per kolom: kolommen 3 tot en met 12). huit puits de chacune des colonnes 3 A 12.
vervolgens ensuite
1.1.5. Pipetteer 50 µl anti-AHSV caviaserum, reeds voorverdund tot de 1.1.5. Ajouter 50 µl d'antisérum de cobaye, préalablement dilué dans
eindverdunning in blockingbuffer, in alle putjes van de ELISA-plaat, le tampon de blocage, A l'ensemble des puits, excepté les puits DE
behalve de blanco's (elk putje bevat nu 100 µl vloeistof). CONTROLE A BLANC de la plaque ELISA (tous les puits contiennent A présent un volume final de 100 µl).
1.1.5.1. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C op een schudapparaat. 1.1.5.1. Incuber pendant 1 heure A 37 °C dans un agitateur rotatif.
1.1.5.2. Was de plaatjes driemaal en sla droog als hierboven omschreven. 1.1.5.2. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment.
1.1.5.3. Pipetteer 50 µl konijn-anticavia-HRP-conjugaat, reeds 1.1.5.3. Ajouter A chaque puits 50 µl de sérum de lapin anticobaye
voorverdund tot de eindverdunning in blocking-buffer, in elk putje. conjugué A de la peroxydase de raifort, préalablement dilué dans un tampon de blocage.
1.1.5.5. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C op een schudapparaat. 1.1.5.4. Incuber pendant 1 heure A 37 °C dans un agitateur rotatif.
1.1.5.5. Was de plaatjes driemaal en sla droog als hierboven omschreven. 1.1.5.4. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment.
1.1.6. Chromogeen 1.1.6. Chromogène
Bereid de chromogeenoplossing OPD (OPD=ortho-phenyldiamine) volgens de Préparer la solution chromogène OPD (OPD = orthophényldiamine) selon
instructies van de fabrikant (0,4 mg per ml in steriel gedistilleerd les instructions du fabricant (0,4 mg/ml dans de l'eau distillée
water) enkele minuten vóór het gebruik. Voeg substraat (H2O2, stérile) juste avant de l'utiliser. Ajouter un substrat (peroxyde
waterstofperoxide) toe tot een eindconcentratie van 0,05 % (v/v) d'hydrogène = H2O2), afin d'obtenir une concentration finale de 0,05 %
(verdunning van 1 op 2 000 van een 30 %-ige oplossing van H2O2). (v/v) (1/2000 d'une solution A 30 % de H2O2). Ajouter 50 µl de la
Pipetteer 50 µl OPD-oplossing in elk putje en laat de plaatjes solution OPD A chaque puits et laisser les plaques sur la paillasse
gedurende 10 minuten bij omgevingstemperatuur staan. Stop de reactie pendant 10 minutes A température ambiante. Stopper la réaction en
met 1M zwavelzuur (H2SO4) (50 µl per putje). ajoutant 50 µl par puits d'acide sulfurique 1M (H2SO4).
1.1.7. Aflezen 1.1.7. Lecture
Lees af met behulp van een spectrofotometer bij een golflengt van 492 nm. Lecture par spectrophotométrie A 492 nm.
1.2. Berekening van de resultaten 1.2. Expression des résultats
1.2.1. Print de OD-waarden en het percentage inhibitie (PI) voor de 1.2.1. A l'aide éventuelle d'un logiciel, déterminer les valeurs de
densité optique (DO) et le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums A
testsera en controlesera, gebaseerd op de gemiddelde waarde van de tester et des sérums de contrôle, sur la base de la valeur moyenne
vier caviaserum controleputjes, uit met gebruikmaking van een speciaal enregistrée dans les quatre puits contenant les sérums-contrôles de
cobaye. Les valeurs DO et PI sont utilisées pour déterminer si le test
softwarepakket. De verkregen OD- en PI-waarden worden gebruikt om te a été exécuté dans les limites acceptables. Les limites supérieures et
bepalen of de testresultaten binnen aanvaardbare grenzen liggen. De inférieures des sérums-contrôles de cobaye se situent respectivement
OD-waarden voor de caviaserum controles liggen tussen OD = 1,4 entre les valeurs 1,4 et 0,4 de DO.
(bovengrens) en OD = 0,4 (ondergrens). De eindpunttiter van de Le titre du point terminal du contrôle positif sur la base d'un PI de
positieve controle, gebaseerd op 50 % PI, zou 1/240 moeten bedragen 50 % devrait être de 1/240 (entre 1/120 A 1/480). Toute plaque non
(tussen 1/120 en 1/480). Elk plaatje dat niet aan bovenstaande conforme aux critères précités doit être rejetée. Toutefois, si le
criteria voldoet, moet worden afgewezen. Indien het positieve titre du sérum de contrôle positif est supérieur A 1/480 et que les
controleserum evenwel een titer te zien geeft die groter is dan 1 op échantillons testés sont toujours négatifs, les échantillons réputés
négatifs peuvent être acceptés.
480 en de testmonsters toch negatief zijn, mogen de negatieve Les puits de sérum de contrôle négatif dédoublés et les puits de
testmonsters worden geaccepteerd.
De PI-waarden van het in duplo geteste negatieve controleserum en de contrôle A blanc dédoublés devraient présenter des valeurs PI
in duplo blanco's moeten liggen tussen + 25 % en - 25 %, comprises respectivement entre + 25 % et - 25 % et entre + 95 % et +
respectievelijk tussen + 95 en + 105 %. Indien deze waarden buiten de 105 %. Le non-respect de ces limites n'a pas pour effet d'invalider
boven-en ondergrenzen liggen, is de test niet als zodanig mislukt maar les résultats de la plaque, mais il laisse supposer la formation d'une
is er mogelijk sprake van een te hoge achtergrondkleuring. couleur de bruit de fond.
1.2.2. De diagnostische drempel (afkapwaarde) voor testsera bedraagt 1.2.2. Le seuil de diagnostic (valeur limite) pour les sérums testés
50 % (PI 50 %). Monsters met een PI-waarde die groter is dan 50 %, est de 50 % (PI 50 %). Les échantillons donnant des valeurs PI
worden als positief beschouwd. Monsters met een PI-waarde die lager is supérieures A 50 % sont considérés comme positifs. Les échantillons
dan 50 %, worden als negatief beschouwd. donnant des valeurs PI inférieures A 50 % sont considérés comme
Monsters met duplo's waarvan één PI-waarde boven en één beneden de négatifs. Les échantillons qui présentent des valeurs PI supérieures ou
diagnostische drempel ligt, worden als twijfelachtig beschouwd. inférieures au seuil pour les puits dédoublés sont considérés comme
Dergelijke monsters kunnen opnieuw worden getest met de spottest of douteux. Ces échantillons peuvent être retestés par test ponctuel ou
door titrering. Positieve monsters mogen ook worden getitreerd om een par titrage. Les échantillons positifs peuvent également être titrés
indicatie te geven van de graad van positiviteit. afin de fournir une indication du degré de positivité.
Proefopstelling spottest Analyse ponctuelle
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
12 12
+ Cont. c +
Testsera Sérums testés
1:5 1:5
- Cont. c-
31 31
32 32
33 33
34 34
35 35
36 36
37 37
38 38
39 39
40 40
1:10 1:10
- Cont. c-
31 31
32 32
33 33
34 34
35 35
36 36
37 37
38 38
39 39
40 40
1:20 1:20
Blank A blanc
1:40 Blank 4 1:80 GP Cont. 1:40 A blanc 1:80 cc
1:160 1:160
GP Cont. cc
1:320 1:320
GP Cont. cc
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
1:640 1:640
GP cont. cc
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
- Cont. = negatieve controle. C - = contrôle négatif.
+ Cont. = positieve controle. GP Cont. C + = contrôle positif.
= Guinea Pig Control (caviacontrole). CC = contrôle de cobaye.
Proefopstelling serumtitrering Titrage du sérum
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
12 12
+ Cont. c +
Testsera Sérums testés
1:5 1:5
- Cont. c-
1:5 1:5
1:5 1:5
1:10 1:10
- Cont. c-
1:10 1:10
1:10 1:10
1:20 1:20
Blank A blanc
1:20 1:20
1:20 1:20
1:40 1:40
Blank A blanc
1:40 1:40
1:40 1:40
1:80 1:80
GP Cont. cc
1:80 1:80
1:80 1:80
1:160 1:160
GP Cont. cc
1:160 1:160
1:160 1:160
1:320 1:320
GP Cont. cc
1:320 1:320
1:320 1:320
1:640 1:640
GP Cont. cc
1:640 1:640
1:640 1:640
- Cont. = negatieve controle. C - = contrôle négatif.
+ Cont. = positieve controle. GP Cont. C + = contrôle positif.
= Guinea Pig Control (caviacontrole). CC = contrôle de cobaye.
2. INDIRECTE ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST) De hieronder beschreven test is in overeenstemming met de testprocedure die is beschreven in hoofdstuk 2.1.11 van het « Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines » van het OIE, vierde editie, 2000. Recombinant VP7 proteïne is gebruikt als antigeen voor de bepaling van antilichamen tegen AHSV met een hoge gevoeligheid en specificiteit. Andere voordelen zijn dat het stabiel is en niet besmettelijk. 2. TEST ELISA INDIRECT POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test décrit ci-après est conforme A la description du chapitre 2.1.11 du manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE, quatrième édition, 2000. La protéine recombinante VP7 a été utilisée comme antigène pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre le virus de la peste équine; la méthode est très sensible et très spécifique. Cette protéine présente également l'avantage d'être stable et non infectieuse.
2.1. Testprocedure 2.1. Description du test
2.1.1. Vaste fase 2.1.1. Phase solide
2.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met recombinant AHSV-4 VP7, verdund in 2.1.1.1. Des plaques ELISA sont sensibilisées avec la protéine
recombinante VP7 du VPE de sérotype 4, diluée dans du tampon
carbonaat/bicarbonaatbuffer. Incubeer de plaatjes gedurende één nacht carbonate/bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques pendant une nuit
bij 4 °C, pH 9,6. A 4 °C.
2.1.1.2. Was de plaatjes vijfmaal met gedistilleerd water dat 0,01 % 2.1.1.2. Rincer les plaques 5 fois avec de l'eau distillée contenant
(v/v) Tween 20 (wasoplossing) bevat. Klop de plaatjes zachtjes af op 0,01 % (v/v) de Tween-20 (solution de lavage). Secouer doucement les
absorberend materiaal om resten van het wassen te verwijderen. plaques sur un matériel absorbant pour enlever toute trace de rinçage.
2.1.1.3. Blokkeer de plaatjes met PBS + 5 % (w/v) magere melk 2.1.1.3. Saturer les plaques avec une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé
(mageremelkpoeder van NestléTM), 200 µl per putje, gedurende 1 uur bij en poudre (lait NestléTM), A raison de 200 µl par puits pendant 1
37 °C. heure A 37 °C.
2.1.1.4. Verwijder de blockingbuffer en klop de plaatjes zachtjes af 2.1.1.4. Enlever la solution de saturation et secouer doucement les
op absorberend materiaal. plaques sur un matériel absorbant.
2.1.2. Testmonsters 2.1.2. Echantillons
2.1.2.1. De te testen serummonsters en de positieve en negatieve 2.1.2.1. Les sérums A tester et les sérums positif et négatif de
controlesera worden verdund in een verhouding 1 op 25 in PBS + 5 % contrôle sont dilués au 1/25 dans une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé
(w/v) magere melk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 µl per putje. Incubeer + 0,05 % (v/v) de Tween-20; ils sont ensuite déposés A raison de 100
gedurende 1 uur bij 37 °C. µl par puits. Incuber pendant 1 heure A 37 °C.
Voor titrering wordt een tweevoudige verdunningsreeks aangelegd te Pour le titrage, réaliser des séries de dilution de 2 en 2 A partir du
beginnen bij 1 op 25 (100 µl/ putje), één serum per kolom, en wordt 1/25e (100 µl/puits), en utilisant une colonne de la plaque par sérum;
hetzelfde gedaan met de positieve en de negatieve controles. Incubeer réaliser la même chose avec les contrôles positif et négatif. Incuber
gedurende 1 uur bij 37 °C. pendant 1 heure A 37 °C.
2.1.2.2. Was de plaatjes als omschreven onder 2.1.1.2. 2.1.2.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2.
2.1.3. Conjugaat 2.1.3. Conjugué
2.1.3.1. Pipetteer in elk putje 100 µl met HRP geconjugeerd anti-paard 2.1.3.1. Déposer 100 µl/puits des anticorps anti-cheval conjugués A la
gamma-globuline, verdund in PBS + 5 % melk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. peroxydase de raifort; ces anticorps sont dilués dans une SSTP + 5 %
Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. de lait écrémé + 0,05 % de Tween-20 de pH 7,2. Incuber pendant 1 heure A 37 °C.
2.1.3.2. Was de plaatjes als omschreven onder 2.1.1.2. 2.1.3.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2.
2.1.4. Chromogeen/Substraat 2.1.4. Chromogène/substrat
2.1.4.1. Pipetteer in elk putje 200 µl chromogeen/substraatoplossing 2.1.4.1. Ajouter 200 µl /puits de la solution de chromogène/substrat
[10 ml van 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml van 1,56 [10 ml de 80,6 mM de DMAB (diméthylaminobenzaldéhyde) + 10 ml de 1,56
mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolin hydrazon hydro-chloride) + 5 µl H2O2]. mM de MBTH (3-méthyl-2-benzothiazoline d'hydrochlorure d'hydrazone) + 5 µl de H2O2].
Kleurontwikkeling wordt gestopt door toevoeging van 50 µl 3N H2SO4 na
5 A 10 minuten (voordat de negatieve controle begint te kleuren). Bloquer après environ 5 A 10 minutes (avant que le contrôle négatif ne
commence A se colorer) la réaction colorimétrique en ajoutant 50 µl de H2S04 3N.
Andere chromogenen, bijv. ABTS D'autres chromogènes tels que le ABTS
(2.2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (2,2'-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique), le TMB
(tetra-methyl benzidine), of OPD (ortho-phenyldiamine) mogen ook (tétraméthyle de benzidine) ou l'OPD (ortho-phényldiamine) peuvent
worden gebruikt. aussi être utilisés.
2.1.4.2. Lees de plaatjes af bij een golflengte van 600 nm (of 620 nm). 2.1.4.2. Lire la plaque A 600 nm (ou 620 nm).
2.2. Interpretatie van de resultaten 2.2. Interprétation des résultats
2.2.1. Bereken de afkapwaarde door 0,6 toe te voegen aan de waarde van 2.2.1. Calculer la valeur du seuil par addition de 0,6 A la valeur du
de negatieve controle (0,6 is de afgeleide standaarddeviatie bij een contrôle négatif (0,6 est 1'écart type calculé A partir d'un groupe de
groep van 30 negatieve sera). 2.2.2. Testmonsters met absorptiewaarden beneden de afkapwaarde worden als negatief beschouwd. 2.2.3. Testmonsters met absorptiewaarden boven de afkapwaarde +0,15 worden als positief beschouwd. 2.2.4. Testmonsters met een tussenliggende absorptiewaarde zijn twijfelachtig en in dat geval moet een tweede methode worden toegepast om het resultaat te bevestigen. 3. BLOKKERINGS-ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST) De blokkerings-ELISA is gericht op het aantonen van specifieke antilichamen tegen AHSV in sera van elke gevoelige diersoort. VP7 is het belangrijkste antigene virusproteïne van AHSV en komt voor binnen 30 sérums négatifs). 2.2.2. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance inférieure au seuil sont considérés comme négatifs. 2.2.3. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance plus grande que le seuil + 0,15 sont considérés comme positifs. 2.2.4. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance intermédiaire sont douteux et une deuxième technique doit être employée pour confirmer le résultat. 3. TEST ELISA BLOQUANT VISANT A DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE) Le test ELISA bloquant est destiné A déceler la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce sensible. La VP7 constitue la protéine antigénique principale du VPE; elle est présente dans les 9 sérotypes. Du fait que
de negen serotypen. Aangezien het monoklonale antilichaam (Mab) ook l'anticorps monoclonal est également dirigé contre la protéine VP7, le
gericht is tegen het VP7, heeft de test een zeer grote gevoeligheid en test sera très sensible et très spécifique. En outre, l'antigène
specificiteit. Voorts is recombinant VP7 antigeen totaal onschadelijk recombinant VP7 est totalement inoffensif et très sûr.
en is bijgevolg een zeer hoge veiligheidsgraad gegarandeerd.
De test is gebaseerd op het onderbreken van de reactie tussen het Le principe du test est la diminution de la réaction entre la protéine
recombinant VP7, d.i. het aan het ELISA-plaatje gebonden antigeen, en recombinante VP7, en tant qu'antigène lié A la plaque ELISA, et
het geconjugeerde Mab dat specifiek is voor VP7. Antilichamen in het l'anticorps monoclonal conjugué, spécifique de la protéine VP7. Les
testserum blokkeren de reactie tussen het antigeen en het Mab, wat anticorps dans les sérums A tester bloqueront la réaction entre
resulteert in vermindering van de kleurontwikkeling. l'antigène et l'anticorps monoclonal, ce qui entraînera une réduction de la couleur.
De hieronder beschreven test wordt uitgevoerd in het communautair Le test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire communautaire
referentielaboratorium voor paardenpest in Algete, Spanje. de référence pour la peste équine de Algete, Espagne.
3.1. Testprocedure 3.1. Description du test
3.1.1. ELISA-plaatjes 3.1.1. Plaques ELISA
3.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met recombinant AHSV-4 VP7, 3.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de 1'antigène du VPE de
voorverdund in carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Incubeer de sérotype 4 avec la protéine recombinante VP7, diluée dans un tampon
plaatjes gedurende één nacht bij 4 °C. carbonate/bicarbonate de pH 9,6, et incuber pendant une nuit A 4 °C.
3.1.1.2. Laver les plaques 5 fois avec une solution saline tamponnée
3.1.1.2. Was de plaatjes vijfmaal met PBST (PBS waaraan 0,05 % (v/v) au phosphate (SSTP) contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20.
Tween 20 is toegevoegd). 3.1.1.3. Stabiliseer de plaatjes door behandeling met een 3.1.1.3. Stabiliser la plaque par traitement A 1'aide d'une solution
stabilisatieoplossing (met het oog op langdurige opslag bij 4 °C de stabilisation (pour permettre un stockage A long terme A 4 °C sans
zonder verlies van werkzaamheid) en sla de plaatjes droog op perte d'activité) et sécher au buvard.
absorberend materiaal.
3.1.2. Testmonsters en controles 3.1.2. Echantillons et contrôles
3.1.2.1. Voor screening : Verdun de testsera en de controles in een 3.1.2.1. Criblage: Diluer les sérums A tester et les contrôles dans la
verhouding 1 op 10, rechtstreeks op het plaatje in PBST, tot een proportion de 1 A 10 directement sur la plaque dans la SSTP afin
uiteindelijk volume van 100 µl per putje. Incubeer gedurende 1 uur bij d'obtenir un volume final de 100 µl par puits. Incuber pendant 1 heure
37 °C. A 37 °C.
3.1.2.2. Voor titrering : Leg een tweevoudige verdunningsreeks aan van 3.1.2.2. Titrage: Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de sérums
de testsera en de positieve controles (100 µl per putje) verdeeld over A tester et de contrôles positifs (100 µl par puits) de 1/10 A 1/1280
8 putjes, gaande van 1 op 10 tot 1 op 1 280. Een negatieve controle A déposer dans huit puits. Le contrôle négatif est testé A une
wordt getest in de verdunning 1 op 10. dilution de 1/10.
3.1.3. Conjugaat 3.1.3. Conjugué
Pipetteer 50 µl voorverdund, aan HRP (horseradish-peroxidase) Ajouter 50 µl d'anticorps monoclonal préalablement dilué (anticorps
geconjugeerd Mab (voor VP7 specifieke monoklonale antilichamen) in elk monoclonal conjugué avec la peroxydase du raifort) dans chaque puits
putje en meng zachtjes om homogeniteit te garanderen. Incubeer et mélanger doucement afin de garantir l'homogénéité. Incuber pendant
gedurende 30 minuten bij 37 °C. 30 minutes A 37 °C.
3.1.4. Was de plaatjes vijfmaal met PBST en sla droog als hierboven 3.1.4. Laver les plaques 5 fois A l'aide de SSTP et sécher au buvard
omschreven. comme décrit ci-dessus.
3.1.5. Chromogeen/Substraat 3.1.5. Chromogène/substrat
Pipetteer 100 µl chromogeen/substraatoplossing in elk putje [(1 ml Ajouter 100 µl par puits de la solution suivante de chromogène/substrat: 1 ml de ABTS
ABTS (2.2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml (2,2-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique]) A 5 mg/ml
+ 9 ml substraatbuffer (0,1M fosfaat-citraatbuffer met pH 4 die 0,03 % + 9 ml de tampon de substrat (0,1M de tampon de phosphate-citrate de
H2O2 bevat)] en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. pH 4 contenant 0,03 % de H2O2), puis incuber pendant 10 minutes A
Stop de kleurontwikkeling door toevoeging van 2 % (w/v) SDS température ambiante. Le développement de la couleur est arrêté par
(natriumdodecylsulfaat) (100 µl per putje). l'addition de 100 µl par puits de SDS (sulfate de sodium dodécyl) A 2 % (m/v).
3.1.6. Aflezen 3.1.6. Lecture
Lees af bij een golflengte van 405 nm in een ELISA-leesapparaat. Lire A 405 nm dans un lecteur ELISA.
3.2. Interpretatie van de resultaten 3.2. Interprétation des résultats
3.2.1. Validering van de test 3.2.1. Validité du test
De test is geldig wanneer de optische densiteit (OD) van de negatieve Le test est valable lorsque la densité optique (DO) du contrôle
controle (NC) hoger is dan 1,0 en de OD van de positieve controle (PC) négatif (CN) est supérieure A 1,0 et que la DO du contrôle positif
lager is dan 0,2. (CP) est inférieure A 0,2.
3.2.2. Berekening van de afkapwaarde 3.2.2. Calcul des limites
Positieve afkapwaarde = NC - ((NC - PC) x 0,3) Limite positive = CN - ((CN - CP) x 0,3)
Negatieve afkapwaarde = NC - ((NC - PC) x 0,2) NC is de OD van de negatieve controle en PC is de OD van de positieve controle. 3.2.3. Interpretatie van de resultaten Monsters met een OD beneden de positieve afkapwaarde worden als positief voor antilichamen tegen AHSV aangemerkt. Monsters met een OD boven de negatieve afkapwaarde worden als negatief voor antilichamen tegen AHSV aangemerkt. Monsters met een OD tussen deze beide waarden worden als twijfelachtig Limite négative = CN - ((CN - CP) x 0,2) CN est la DO du contrôle négatif et CP est la DO du contrôle positif. 3.2.3. Interprétation des résultats Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO inférieures A la limite positive doivent être considérés comme positifs. Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO supérieures A la limite positive doivent être considérés comme négatifs. Les échantillons présentant des DO comprises entre ces deux valeurs doivent être considérés comme douteux et des échantillons doivent être
aangemerkt en de betrokken dieren moeten 2 A 3 weken later opnieuw prélevés de nouveau sur les animaux après 2 A 3 semaines. »
worden bemonsterd. Gezien om gevoegd te worden bij ons besluit van 28 juni 2009 tot Vu pour être annexé A notre arrêté du 28 juin 2009 modifiant l'arrêté
wijziging van het koninklijk besluit van 26 januari 1993 betreffende royal du 26 janvier 1993 relatif A la lutte contre la peste équine.
de bestrijding van paardenpest. La Ministre de la Santé publique,
De Minister van Volksgezondheid,
Mevr. L. ONKELINX Mme L. ONKELINX
De Minister van Landbouw, La Ministre de l'Agriculture,
Mevr. S. LARUELLE Mme S. LARUELLE
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